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EVALUACIÓN DE DOS TÉCNICAS DE RECOGIDA PARA EL AISLAMIENTO DE Candida sp

EVALUTION OF TWO TECHNIQUES OF COLLECTION FOR THE ISOLATION OF Candida sp

 

Cátia Rezende1,
Renata Camacho Miziara2,
Ana Paula Facio3,
Ana Roberta Pinheiro3, Ana Claudia Facio3,
Lucas Chierentin3,
Renata Hebling Marins4,
Raphael Carlos Comelli Lia5

1. Máster en Biotecnología, titular de la disciplina de Microbiología del Centro Universitario de FEB. catia_rezende@terra.com.br
2. Doctorado en Genética, Ayudante de la disciplina de Microbiología del Centro Universitario de FEB. renatacamacho@hotmail.com
3. Estudiantes de licenciatura de Farmacia del Centro Universitario de FEB
4. Máster en Patología, Ayudante de la disciplina de Patología del Centro Universitario de FEB. remarins@hotmail.com.
5. Profesor Adjunto, Titular de Patología en la UNESP – Araraquara. raphael_lia@ yahoo.com.br


Recibido 27 de Enero 2012/Enviado para modificación 02 de Marzo 2012/ Aceptado 28 de Marzo 2012

 

RESUMEN

Objetivo
. Evaluar la presencia de Candida spp en un grupo de portadores de prótesis dental, correlacionando la eficacia de dos técnicas de colecta de material biológico (hisopado e impresión en disco). Métodos. Fueron seleccionados 22 voluntarios sin historia previa de uso de antimicóticos. Las muestras para análisis micológico fueron colectadas por la técnica de impresión por medio de discos en papel de filtro y por la fricción con hisopo estéril, de la mucosa del paladar, cara interna de la prótesis y del dorso de la lengua. Agar Sabouraud adicionándole cloranfenicol como medio de cultivo utilizado para el primo-aislamiento. La identificación fue realizada utilizando las siguientes pruebas: producción de clamidoconídio, fermentación y asimilación de carbohidratos. Resultados. 17 voluntarios presentaron resultado positivo cuando fue utilizada la técnica de impresión y 14 voluntarios para la técnica del hisopado. Los modelos de regresión logística mostraron que los métodos de colecta (hisopado o impresión) no influenciaron significativamente sobre el crecimiento de la levadura en los lugares estudiados (prótesis, mucosa y dorso). Conclusiones. El análisis mostró que el método de colección no es un factor determinante en la presencia de la levadura, en tanto en los hábitos de los pacientes que tenían relevancia.

Palabras clave: hisopado; impresión en disco; Candida spp; factores predisponentes.

ABSTRACT

Objective. This study aimed to correlate two techniques (swab and imprinting) with risk factors of the host and the presence of Candida spp in the study group, patients with denture, using the statistic technique of logistic regression. Methods. We selected 22 volunteers with no history of use of antifungals. Samples for mycological analysis were collected by the printing technique using filter paper discs and friction with sterile swab, of palate mucosa, inside of prosthesis and the back of the tongue. Sabouraud agar adding chloramphenicol was the culture medium used for the isolation. The identification was made using the following tests: chlamidospores production, fermentation and assimilation of carbohydrates. Results. 17 volunteers showed positive results when it was used printing technique and 14 to swab technique. Logistic regression models showed that the methods of collection (swab or impression) did not significantly influence the growth of yeast in the areas studie (prosthesis, mucosal and back of the tongue). Conclusions. The analysis showed that the method of collection is not a determining factor in the presence of yeast; however, the habits of the patients had relevance.

Key-words: swab, imprint, Candida spp, predisponents factors.

 

INTRODUCCIÓN

En la última década, se han incrementado notoriamente el número de patógenos micóticos emergentes. Esta alteración en el perfil de las micosis invasivas es probablemente una combinación de factores, donde se incluyen: enfermedades malignas, avances en los trasplantes de órganos, aumento del número de pacientes sobre tratamiento médico invasivo y uso de drogas antimicrobianas (1).

Las levaduras del genero Candida tienen gran importancia por la frecuencia con la que colonizan e infectan al hospedero humano, siendo ampliamente demostrado, que estas hacen parte de la microbiota normal del tracto digestivo en un 20 a 80% de la población adulta saludable (1,2).
La cavidad oral está constantemente expuesta a diferentes estímulos, sean biológicos, mecánicos, térmicos y químicos, en el transcurso de los actos fisiológicos inherentes, se destaca la masticación; esta presenta también predisposición a desenvolver alteraciones decurrentes de modificaciones sistémicas, las cuales podrán desencadenar un desequilibrio biológico entre microorganismos de la cavidad oral y el hospedero, llevando a la instauración de un cuadro infeccioso (3).

La Candidiasis expresa variedad de relaciones que ocurren entre el hospedero y la microbiota comensal autóctona, a partir del comensalismo, esta enfermedad sistémica es fatal. Se sabe que las infecciones ocasionadas por Candida ssp presentan etiología multifactorial. La transformación de la forma saprofita para la parasitaria está relacionada con varios factores (1). La transición de esta condición comensal para una situación de parasitismo está relacionada con los factores del hospedero y raramente con el de las levaduras (4).

Los factores relacionados con el hospedero pueden ser divididos de la siguiente forma: presencia de prótesis, oclusión insatisfactoria, higiene bucal inadecuada, consumo de una dieta rica en carbohidratos, xerostomía; y factores sistémicos donde podemos destacar los siguientes: fisiológicos, antibioticoterapia, fumadores, corticosteroides, desnutrición, desordenes endocrinos, malignidad e inmunológicos (5).
Existen más de 150 especies diferentes de Candida, cerca de 40 especies pueden ser aisladas de la cavidad oral de los seres humanos. En relación a la frecuencia de las especies involucradas en la candidiasis oral, la Candida (C) albicans es la más común, principalmente en pacientes inmunosuprimidos (6-8). Otras especies como la C. tropicalis, C. glabrata, C. krusei, C. guilliermondi y la C. parapsilosis han sido descritas en varios estudios (7,9).

Variaciones en los resultados de cultivos micológicos pueden ser dependientes del método de colecta utilizado. La colecta del espécimen clínico para la investigación de la Candida puede ser realizada a través de varias técnicas: extendido, hisopado, buches, cultivo por impresión, colecta de saliva y biopsia de la mucosa. Algunos estudios sugieren que la técnica de impresión con discos de papel parece ser un buen padrón para estudios en superficies de prótesis y de mucosa oral, en comparación con las técnicas de muestra salivar, de impresión con moldes de alginato y del raspado epitelial (con espátula de madera) (10).

El presente estudio tiene como propuesta evaluar la presencia de Candida spp en un grupo de portadores de prótesis dental, correlacionando la eficacia de dos técnicas de colecta de material biológico (hisopado e impresión en disco).


MATERIALES Y MÉTODOS

Selección de los voluntarios

Fueron seleccionados 22 voluntarios, funcionarios del Centro Universitario de la FEB, portadores de prótesis total y/o parcial, sin historia previa de uso de antimicóticos por un mínimo de seis meses previos. Fueron registrados datos personales como nombre, fecha de nacimiento, nacionalidad, estado civil, sexo, etnia, profesión; historia médica (enfermedades, uso de medicamentos, hábitos de fumar, consumo de alcohol, uso de drogas, hábitos alimenticios) e historia odontológica (tiempo de uso de la prótesis, hábitos de higiene de la prótesis, de la cavidad oral y por último la calidad de la prótesis). Este estudio fue aprobado por la Comisión de Ética en la Investigación.

Colecta micológica
Las muestras para análisis micológico fueron colectadas por la técnica de impresión por medio de discos en papel de filtro Whatman (Whatman Laboratory Division, Maidstone, Inglaterra), previamente esterilizados por autoclave y por la fricción con hisopo estéril. La colecta fue realizada de la mucosa del paladar, cara interna de la prótesis y del dorso de la lengua. De esta forma, fueron colectadas 3 muestras de cada voluntario, para cada técnica utilizada, totalizando 132 muestras colectadas (66 muestras de cada técnica). Todo procedimiento de colecta fue realizado en el laboratorio de Análisis Clínica del Centro Universitário de la FEB.

Aislamiento de la Candida
El disco de papel de filtro fue colocado directamente en la placa de Petri con el medio de cultivo, fue puesto con la cara de contacto volteada para este. El medio de cultivo utilizado para el primo-aislamiento fue Agar Sabouraud adicionándole cloranfenicol e incubado a temperatura ambiente por 48 horas. Este medio de cultivo permitió la identificación preliminar de la Candida. Posteriormente a la incubación, las placas fueron sometidas a una evaluación cuantitativa.

Identificación de las especies de la Candida
Fueron seleccionadas colonias de las placas con cultivos positivos, siendo repicadas en tubos de ensayo conteniendo agar Sabouraud con cloranfenicol. La identificación fue realizada utilizando las siguientes pruebas: producción de clamidoconídio, fermentación y asimilación de carbohidratos. Las levaduras identificadas como C. albicans fueron sometidas a pruebas de crecimiento a 42oC.

Análisis estadístico
Para evaluar el crecimiento de la levadura en los lugares estudiados utilizando las dos técnicas anteriormente citadas, fue aplicado el modelo logit, basado en la función logística acumulativa. Es importante destacar, que cuando se analizaron los resultados obtenidos mediante el método estadístico de regresión logística, el cual tiene por objeto producir a partir de un conjunto de observaciones, un modelo que permita la predicción de valores tomados por una variable medida en categorías, frecuentemente binarias, a partir de una serie de variables explicativas continuas o categóricas; con el propósito de, calcular la probabilidad de que ocurra un determinado evento cualitativo; De tal forma, un evento aparentemente con valores discretos puede asumir valores continuos estimados. En el presente trabajo las variables respuestas (y) categóricas, hacen referencia al crecimiento de hongos en la prótesis, la mucosa y el dorso de la lengua, cada una con cuatro categorías, siendo estas: 0=ausencia, 1=bajo crecimiento, 2=moderado crecimiento y 3=alto crecimiento. Y las variables explicativas, también categóricas, que correspondieron al método de coleta para análisis (1-discos de papel de filtro, 2- Hisopado), uso continuo de la prótesis (0 o 1), hábito de fumar (0 o 1), uso de enjuague bucal (0 o 1), uso de medicamentos (0 o 1) y presencia de enfermedades sistémicas (0 o 1), donde “1” y “0” corresponden y designan la presencia o ausencia del evento. El principal objetivo de este modelo es calcular la probabilidad de que ocurra un determinado evento cualitativo, dados los niveles de las variables explicativas.

RESULTADOS

Dentro de los 22 voluntarios examinados, con una media de edad de 50,20 +/- 12 años, 15 (68,2%) eran mujeres. Fue relatada presencia de enfermedad sistémica por 17 voluntarios, siendo la del sistema cardiovascular (hipertensión arterial) la más frecuente; 19 voluntarios citaron usar medicamentos continuamente, siendo los antihipertensivos la medicación más común. Además, 4 voluntarios presentaban el hábito de fumar.
En lo concerniente a la historia odontológica, en cuanto al uso de la prótesis la experiencia de uso de los voluntarios indicó una media de 18 años; 12 utilizaban la prótesis todo el día tanto en el periodo de la mañana como en el de la noche, y 10 solamente en el periodo de la mañana. De los 12 voluntarios que utilizaban continuamente la prótesis, el 100% presentaron Candida spp; sin embargo, de los 10 voluntarios que hacían uso solamente en el período de la mañana, 50% presentaron la presencia de la levadura.

Al analizar los hábitos de higiene de la cavidad oral y de la prótesis, los voluntarios relataron que realizaban la limpieza a diario; no obstante, solo 9 voluntarios enjaguaban la prótesis en soluciones comerciales. De estos, 5 presentaron resultados negativos para la levadura. El 100% de los voluntarios que no realizaban el enjuague presentaron resultados positivos, confirmando la presencia de la levadura.

Al correlacionar enfermedad sistémica, uso de medicamentos y presencia de Candida spp, los datos sugieren que algunas enfermedades sistémicas pueden contribuir en la colonización de la levadura; pues de los 17 voluntarios que relataron enfermedad sistémica, 15 (88,2%) fueron positivos y de los 5 que no tenían enfermedad sistémica, 2 (40%) fueron positivos. Al correlacionar la presencia de la levadura con el uso de medicamentos, 84,2% (16 voluntarios) de los que utilizaban medicamentos fueron positivos y el 33,3% que no utilizaban medicamentos (1 voluntario) también presentaron resultados positivos.
En el presente estudio, 4 voluntarios relataron el hábito de fumar y todos los resultados que confirmaban la presencia de la levadura fueron positivos. La correlación entre los datos de la historia médica y odontológica obtenidos por el cuestionario aplicado a los 22 voluntarios está descrita en la Tabla 1.

Tabla 1. Relación de la historia médica y odontológica obtenida a través del cuestionario aplicado a los 22 pacientes analizados.

De las 66 muestras colectadas por hisopado (22 de la mucosa oral, 22 de la superficie interna de la prótesis y el dorso de la lengua), 34 presentaron positividad para Candida spp, siendo 12 (35,3%) muestras de la prótesis, 10 (29,4%) de la mucosa oral y 12 (35,3%) del dorso de la lengua. El análisis micológico obtenido por la técnica de colecta con el hisopado demostró ser positivo para 14 pacientes. Los voluntarios 3, 8, 10, 11, 18, 19 y 20 presentaron aislamiento en los tres lugares analizados (prótesis, mucosa oral y dorso de la lengua). A diferencia, los voluntarios 1 y 9 presentaron aislamiento en la mucosa oral y dorso de la lengua, y los voluntarios 2 y 14 en la prótesis y dorso de la lengua. El voluntario 4 fue el único positivo en el análisis de una muestra (prótesis) (Tabla 2).

Tabla 2. Demostración de las muestras de los pacientes que fueron positivos a la Candida spp por las técnicas de colecta utilizando hisopado e impresión con disco de papel.

De las otras 66 muestras por impresión (22 de la mucosa oral, 22 de La superficie interna de la prótesis y del dorso de la lengua), 38 expresaron resultados positivos para la Candida spp, de los cuales eran 13 (34,2%) muestras de la prótesis, 11 (29%) de la mucosa oral y 14 (36,8%) del dorso de la lengua. El análisis micológico obtenido por la técnica de colecta con impresión demostró ser positivo para 17 voluntarios. Los voluntarios 1, 8, 10, 18, 19, 20 y 22 presentaron aislamiento en los tres lugares analizados (prótesis, mucosa oral y dorso de la lengua). Los voluntarios 3 y 9 obtuvieron aislamiento en las muestras de la prótesis y del dorso de la lengua; los voluntarios 4,14 y 21 presentaron aislamiento en la prótesis y mucosa oral; los voluntarios 2, 6 y 17 presentaron 1 muestra positiva, todas del dorso de la lengua. Los resultados están representados en las Tablas 3, 4 y 5.

Las especies de Candida aisladas de los 17 voluntarios (positivos) fueron Candida albicans, Candida tropicalis y Candida krusei. Los voluntarios 1, 3, 4, 8, 10,11,12,14,17,18 y 19 presentaron resultado positivo para C. albicans, por otro lado, los voluntarios 2, 9 y 19 manifestaron la C. tropicalis y el voluntario 6 la C. krusei. El voluntario 19 fue el único con dos especies (C. albicans e C. tropicalis).

Tabla 3. Resumen del modelo logístico para la variable respuesta crecimiento del hongo en la prótesis.

Tabla 4. Resumen del modelo logístico para la variable respuesta crecimiento del hongo en la mucosa oral.

Tabla 5. Resumen del modelo logístico para la variable respuesta crecimiento del hongo en dorso de la lengua.

 

DISCUSIÒN

La colonización de las superficies externa e interna de los seres humanos se inicia al nacimiento. Sin embargo, cada superficie posee propiedades físicas y biológicas propias, llevando a una microbiota diversificada, que normalmente convive en armonía con el hospedero (10,11).

Dentro de los lugares anatómicos, la cavidad oral es uno de los mas colonizados, siendo identificadas más de 500 especies de microorganismos. La Candida constituye una pequeña parte de esa microbiota (2).

La prevalencia de especies de Candida como comensal en la cavidad oral en individuos saludables varía entre 20 a 75% (8). En este estudio, 77,3% de los pacientes evaluados presentaron crecimiento de especies de Candida. Datos superiores (84%) fueron relatados por Teixeira y Mezzari (11). No obstante, en condiciones desfavorables puede ocurrir un desequilibrio y la misma se torna patogénica. La manifestación de la enfermedad está relacionada a un conjunto de factores: mecánicos, térmicos y químicos sufridos por la cavidad oral (4).

Los factores relacionados con el hospedero pueden ser: la presencia de prótesis, la higiene inadecuada, la desnutrición, las enfermedades sistémicas, la utilización de medicamentos, y el hábito de fumar (12,13). De los 22 voluntarios evaluados, 17 presentaron presencia de Candida spp; de estos, los principales factores predisponentes relatados en el cuestionario fueron: enfermedad sistémica (14 pacientes), utilización continua de la prótesis, hábito de fumar, no uso de enjuague bucal y utilización de medicamentos.

Trabajos relataron una fuerte asociación entre personas de la tercera edad con el mayor desenvolvimiento de infección oral por la Candida, pues estos presentan más de un factor predisponerte (14).

En este estudio, la variable explicativa “uso continuo de prótesis” contribuyó significativamente para el crecimiento de la levadura en la prótesis y en la mucosa (Tabla 3 y 4). De otra forma, la variable explicativa “hábito de fumar” tuvo influencia apenas sobre el crecimiento de la levadura en la prótesis. Este resultado fue relatado por otros estudios (15). En el análisis del crecimiento sobre la lengua, no hubo influencia significativa de la variable explicativa del modelo.
Un grande número de métodos de colecta han sido desarrollados para evaluar la presencia de la Candida, los cuales tienen un importante papel en el diagnóstico y tratamiento de patologías (10). Dentro de los métodos más comunes y utilizados, las técnicas de impresion, buches, extendido, hisopado, colecta de saliva total y biopsia son las más citadas (10,16).

En este estudio, fueron utilizadas las técnicas de coleta por el hisopado y por impresión (disco de filtro). Posterior al análisis de los resultados, 17 voluntarios presentaron resultado positivo cuando fue utilizada la técnica de impresión y 14 voluntarios para la técnica del hisopado. Estas dos técnicas demostraron ser eficaces en otros estudios (1,17). No obstante, los modelos de regresión logística mostraron que la variable explicativa “métodos de colecta (hisopado o impresión)” no influencio significativamente sobre el crecimiento de la levadura en los lugares estudiados (prótesis, mucosa y dorso) (Tablas 3, 4 y 5).

Métodos fenotípicos y sistemas comerciales son cada vez más utilizados en la discriminación de las especies de Cándida (18). El CHROMagar Candida, es un test ampliamente utilizado en la diferenciación de especies de Candida, tanto de la cavidad oral como de otras fuentes y materiales clínicos. Sin embargo, la tonalidad de las colonias utilizadas en la identificación, puede ocasionalmente generar dudas y resultados cuestionables, necesitándose confirmar el test con la asimilación de carbohidratos (auxanograma) (1,19). Por consiguiente, este estudio usó metodologías confiables para la identificación de las especies de Candida.
Las metodologías utilizadas en la identificación de las especies de Candida también fueron relatadas en otros estudios, donde se obtuvieron resultados confiables y satisfactorios (11).

En relación a la frecuencia y distribución de las especies envueltas en la candidiasis oral, la Candida albicans es el agente más frecuentemente encontrado, seguido de la C. parapsilosis, C. glabrata, C. tropicalis y C. krusei (7,9,17,20,21,22).

Oliveira y colaboradores relataron que la especie predominante encontrada en la cavidad oral de los pacientes estudiados fue C. albicans con 64,5% de los cultivos positivos (1). Las especies C. parapsilosis,C. kefyr, C. norvegiensis, C. humicola, C. lusitaneae, C. krusei, C. glabrat y C. tropicalis también fueron identificadas.

La especie Candida albicans es la más frecuente en relación a las otras especies del genero como agente colonizador de las prótesis dentarias (6,8). Esta ha sido un factor predisponente para la colonización oral de las especies, teniendo relación con los hábitos de higiene oral, limpieza de la prótesis dentaria y el comportamiento de la levadura (23).

Muestras de individuos sanos que usaban prótesis dentales fueron evaluadas, demostrándose que la C. albicans estaba presente en el 58% de las muestras y el 26% presentaron especies diferentes a la C. albicans (11).
Por tal razón, los análisis apuntan a que el método de colecta no es un factor determinante en la evaluación de la presencia de la levadura en la boca de los pacientes, por otro lado, los hábitos de los pacientes poseen relevancia sobre el crecimiento de la levadura en la prótesis, la mucosa y el dorso.

 

REFERENCIAS

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