v1n1a02

Artículos Originales

 

EFICACIA DESINFECTANTE DEL ÁCIDO HIPOCLOROSO SOBRE CEPAS CON PODER PATOGÉNICO DE CAVIDAD ORAL *

 

DISINFECTANT EFFICACY ON HYPOCHLOROUS ACID PATHOGENIC STRAINS OF ORAL CAVITY

 

Gloria Inés Lafaurie, Aya María del Rosario, Silie Arboleda, Andrea Escalante, Diana Marcela Castillo, Lina Viviana Millán, Justo Calderón y Blanca Nieves Ruiz

Unidad de Investigación Basica Oral, UIBO, Facultad de Odontología, Universidad El Bosque. Bogotá, Colombia. investigaodonto@unbosque.edu.co.

* Este trabajo fue financiado parcialmente por Aquilabs Ltda

 


RESUMEN

Objetivo Evaluar la eficacia antimicrobiana del ácido hipocloroso sobre microorganismos con potencial patogénico en cavidad oral. Métodos Se evaluó la efectividad antimicrobiana y anti fúngica del ácido hipocloroso en concentraciones de 125, 250, 500, 1000 y 1500 ppm a diferentes tiempos de acción: 1, 5, 10 y 15 minutos, sobre diferentes cepas bacterianas ATCC y sobre Candida albicans ATCC 90028. Se empleó la técnica de Kelsey Maurer, verificando la presencia o ausencia de unidades formadoras de colonias (UFC). Cada ensayo se realizó por triplicado con sus respectivos controles de viabilidad. Resultados Se logró inhibición bacteriana a una concentración de 500 ppm durante 1 minuto para S. sanguis, S. mutans, E. faecalis, E. corrodens, C. rectus, F. nucleatum, E. cloacae, K. oxytoca y K. pneumoniae. Los resultados indican que el ácido hipocloroso se constituye como una alternativa antimicrobiana para bacterias con capacidad patogénica en la cavidad oral. Conclusiones La C. albicans se inhibió a una concentración de 500 ppm por 10 minutos, lo que indica bajo poder anti fúngico. Se requieren estudios clínicos para evaluar la efectividad del ácido hipocloroso in vivo.

Palabras clave: Ácido hipocloroso, placa dental, cavidad oral, antimicrobianos.


ABSTRACT

Objetive proposed as an alternative for the inhibition of dental plaque deposition and as a non-antibiotic antimicrobial substance for use in odontogenic infections. The aim of this study was to evaluate the antimicrobial efficacy of hypochlorous acid on potentially pathogenic oral microorganisms. Methods The antimicrobial and antifungal efficacy of this acid was evaluated in concentrations (125, 250, 500,1000 and 1500 ppm) at different times (1,5,10 and 15 minutes) over diverse ATCC oral species and C. albicans. The Kelsey Maurer technique was used to assess the presence or absence of colony forming units (CFU) and each assay was performed in triplicate with viability controls. Results Bacterial inhibition was achieved after 1 minute at 500 ppm concentration for S. sanguis, S. mutans, E. corrodens, C. rectus, F. nucleatum, E. faecalis, E. cloacae, K. oxytoca, K. pneumonia. The results indicate that hypochlorous acid is an antimicrobial alternative for oral bacteria with pathogenic potential. Conclusions The C. albicans was inhibited at 500 ppm concentration after 10 minutes, which indicates a lower antifungal power. Clinical studies are required to evaluate in vivo effectiveness of hypochlorous acid.

Key words: Hypochlorous acid, dental plaque, oral cavity, antimicrobials.


 

INTRODUCCIÓN

La cavidad oral provee un microambiente ideal para el crecimiento de múltiples especies bacterianas. Dentro de la flora oral se pueden encontrar especies residentes que componen la flora normal así como bacterias transeúntes y otras asociadas a enfermedad. La placa dental es uno de los tipos de biofilm o biopelícula más estudiados y es la forma de crecimiento más frecuente de las bacterias de la cavidad oral (1). La caries dental y la enfermedad periodontal constituyen las enfermedades orales de mayor impacto poblacional en muchos países industrializados y en la mayoría de los países en desarrollo y son consideradas enfermedades prevenibles mediante un correcto control de la placa dental (2).

Múltiples estudios han comprobado que la eliminación mecánica de placa dental de manera controlada, reduce significativamente la cantidad de la misma y procesos de gingivitis (3). Buscando una reducción más efectiva del biofilm dental, se han desarrollado múltiples sustancias antimicrobianas para inhibir la formación de placa sobre las superficies dentales. Sin embargo, los antisépticos a diferencia de los antibióticos, son potencialmente tóxicos para agentes infecciosos y células del huésped, por lo tanto, su aplicación en los seres humanos se limita a heridas infectadas, la piel y mucosas (2, 4). La formación de biopelícula dental ha sido ampliamente estudiada y caracterizada y actualmente se conocen las interacciones necesarias para que se inicie el proceso de formación así como la secuencia de llegada y ubicación de las especies asociadas a dicha comunidad. La flora normal mantiene en equilibrio el ecosistema oral y reduce la posibilidad de infecciones por patógenos exógenos. Desde este punto de vista, se puede decir que los tratamientos pueden apuntar a controlar más no a erradicar la placa dental (1).

En algunas circunstancias clínicas en odontología, se hace necesaria la utilización de sustancias antimicrobianas de alta potencia. Los pacientes con enfermedades periodontales severas y pacientes con alto riesgo de caries dental pueden requerir protocolos de desinfección de cavidad oral. La clorhexidina ha sido la sustancia más efectiva en la inhibición de la placa dental y es altamente utilizada para protocolos de desinfección completa de la boca (5, 6, 7). Sin embargo, algunos efectos secundarios sobre las mucosas, alteración en la sensación del gusto y pigmentaciones extrínsecas limitan su uso clínico (8).

Buscando una alternativa para uso clínico en odontología, se propone evaluar el acido hipocloroso (HOCl). El HOCl, hace parte de un grupo de moléculas conocidas como Aganócidos (9), es decir, sustancias antimicrobianas no antibióticas, biológicamente sintetizadas por Neutrófilos y macrófagos durante un proceso inmunológico conocido como estallido respiratorio, que ocurre como resultado del proceso de fagocitosis. El HOCl es un ión no disociado del cloro, dependiente del oxigeno, altamente inestable y altamente reactivo. Por ser uno de los ácidos hipohalogenados más fuertes, es también uno de los más poderosos oxidantes entre los oxácidos clorados y es el responsable directo de la acción bactericida de los compuestos derivados del cloro (10). Químicamente el HOCl puede ser obtenido por diferentes métodos. Infortunadamente, la mayoría de los procedimientos obtienen soluciones de baja estabilidad, moderada actividad microbicida, con bajo porcentaje de ácido hipocloroso libre y mal toleradas por los tejidos en usos prolongados.

En Colombia en 1992, se obtuvo la molécula de HOCl con una estabilidad superior a un año, permitiendo el desarrollo e investigación profunda del compuesto, hasta lograr la primera formulación farmacéutica en el mundo a base de HOCl, certificada con el registro INVIMA número 2004M-0003037. Esta formulación está indicada como solución antiséptica para el tratamiento y cuidado de heridas en patologías de miembros inferiores como: ulceras venosas, arteriales, traumas venosos, pie diabético (11), como solución para el lavado y cuidado de heridas abiertas y quemaduras de segundo y tercer grado (12). Adicionalmente, los estudios de toxicidad aguda a nivel oral, inhalatorio, dérmico, cutáneo, ocular, intravenoso e intraperitoneal del HOCl en animales de laboratorio (ratas Wistar y conejos Nueva Zelanda) establecieron como dosis letal50 las concentraciones mayores a 5000mg/Kg de peso (DL50 >5000mg/Kg), sin evidenciar signos de toxicidad sistémica en los animales en estudio, durante los tiempos y concentraciones evaluadas.

Así mismo, se ha evaluado la actividad bactericida del HCIO utilizando la técnica de Kelsey Maurer en condiciones controladas de temperatura, concentración y tiempo de acción, encontrándose que el HCIO es efectivo al 99.9% a concentraciones iguales o mayores a 900 ppm, luego de 10 minutos de acción para todas las cepas estudiadas (13). Otros estudios muestran que el HOCl es un antimicrobiano de amplio espectro en concentraciones que van desde 0.1 a 2.8 µg/mL en un periodo de exposición de 2 min. (Excepto Streptococcus pyogenes que requiere aproximadamente de 10 minutos de acción). Esta actividad microbicida, a pesar de ser más efectiva para formas bacterianas que para esporas y hongos, muestra efectividad antimicrobiana para microorganismos de alto impacto clínico como S. aureus, S. aureus meticilino resistente, E. faecium vancomicina-resistente y esporas de Bacillus anthracis (9).

Evaluando las propiedades del ácido hipocloroso, este agente podría ser utilizado como sustancia antimicrobiana en cavidad oral. Sin embargo, debido a la complejidad de la flora oral, se hace necesario evaluar la eficacia del ácido hipocloroso como agente antimicrobiano en microorganismos con poder patogénico en cavidad oral. El propósito de este estudio fue evaluar el efecto antimicrobiano del HOCL sobre bacterias Gram positivas, anaerobias y sobreinfectantes como E. cloacae, K. oxytoca y K. pneumoniae y su efecto anti fúngico sobre Candida albicans.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Para la evaluación del efecto antimicrobiano del ácido hipocloroso in vitro, se utilizó la técnica de Kelsey Maurer que se basa en la comprobación, en condiciones reales, de la eficacia de un desinfectante, para ello, se observa el crecimiento o no de colonias en los diferentes medios de cultivo después de sembrar la dilución de la suspensión bacteriana y el desinfectante, una vez que han transcurrido los tiempos a evaluar (14, 15).

Cepas evaluadas: Cepas evaluadas: Se estudiaron bacterias con potencial patogénico en cavidad oral, a saber: bacterias Gram positivas: Streptococcus sanguis ATCC 10556, Streptococcus mutans ATCC 25175 y Enterococcus faecalis ATCC 29212. Microorganismos anaerobios: Porphyromonas gingivalis ATCC 33277, Aggregatibacter actinomycetemcomitans ATCC 29523, Eikenella corrodens ATCC 23834, Campylobacter rectus ATCC 33238 y Fusobacterium nucleatum ATCC 25586. Microorganismos sobre infectantes: Enterobacter cloacae ATCC 13047, Klebsiella oxytoca ATCC 43086, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 y Candida albicans ATCC 90028.

Suspensión bacteriana: Se preparó una suspensión del microorganismo a evaluar (bacteria o levadura), en 5ml de caldo BHI hasta obtener una turbidez equivalente a la escala 1 de Mc Farland (absorbancia entre 0.16 - 0.20 a una longitud de onda de 620 nm) (16).

Medios de cultivo: Se realizaron diversos ensayos con el fin de determinar el medio de cultivo apropiado para cada una de las bacterias evaluadas, considerando las diferencias metabólicas y los requerimientos nutricionales de las mismas. Para bacterias Gram positivas se utilizó el medio BHI (Brain Hearth infusión), para bacterias entéricas se usó el medio Müeller Hinton y para bacterias anaerobias se empleó el medio BHI suplementado con hemina (5µg/ml), menadiona (0,5mg/ml), extracto de levadura (2 µg/ml) y L-cisteína (1%). Candida albicans se sembró en agar Saboureaud.

Determinación de la viabilidad:Este procedimiento se llevó a cabo para verificar la viabilidad de las cepas en estudio y además para estimar el número de UFC que se pusieron a prueba frente al desinfectante. Se prepararon 6 diluciones seriadas en base 10 de la suspensión bacteriana, utilizando como diluyente caldo de dilución (VMGA I). Posteriormente, se sembró 1 ml de la dilución 10-6, por profundidad y se dispensaron aproximadamente 15 ml del agar correspondiente a una temperatura de 45°C, según el microorganismo. Las cajas se mezclaron con movimientos de rotación y una vez solidificado el agar se incubaron de acuerdo a las necesidades de la bacteria. Finalmente, se realizó el recuento de colonias y el resultado se multiplico por el factor de dilución 106, lo que corresponde al inoculo bacteriano real.

Desinfectante: Se evaluó el ácido hipocloroso en concentraciones de: 125 ppm, 250 ppm, 500 ppm, 1000 ppm y 1500 ppm.

Prueba con el desinfectante. En un tubo falcón estéril se colocaron 4,5 ml del desinfectante en sus diferentes concentraciones; se agregaron 500 µl de la suspensión bacteriana y se homogenizó en vortex por 10 segundos. Se dejó actuar durante 1, 5, 10 y 15 minutos y se realizó la siembra de la suspensión correspondiente a cada uno de los tiempos, de la misma manera que se hizó para el control de viabilidad y bajo las mismas condiciones de incubación de acuerdo con el microorganismo estudiado. Se vertió 1 ml de dicha suspensión en una caja de petri estéril. Se sirvieron 15 ml de agar a 45 ºC y se homogenizó con movimientos rotatorios, una vez solidificados, se llevaron a incubación, las bacterias anaerobias se incubaron en condiciones de anaerobiosis (Anaerogen, Oxoid, Hampshire, England) a 37º C durante siete días, las bacterias aerobias y C. albicans se incubaron durante 24-48 horas en condiciones de aerobiosis a 37ºC. Este procedimiento se realizó por triplicado para cada uno de los tiempos y concentraciones.

Lectura de las pruebas: Se verificó la presencia o ausencia de unidades formadoras de colonias (UFC) a las diferentes concentraciones: 125, 250, 500, 1000, 1500 ppm y en los diferentes tiempos: 1, 5, 10 y 15 minutos. En los medios de cultivo que presentaron crecimiento, se realizaron resiembras para confirmar la pureza de los microorganismos.

Porcentaje de efectividad: Del control de viabilidad se realizó el recuento de las colonias de la dilución 10-6 y se multiplicó por el factor de dilución, lo que equivale al 100 % de inóculo bacteriano.

Ensayo de eficacia: Se contó el número de colonias a los diferentes tiempos para cada una de las concentraciones y temperaturas probadas. Se aplicó una regla de tres para determinar el porcentaje (%) de crecimiento bacteriano resistente al efecto del HOCl.

Análisis estadístico: Se utilizó estadística descriptiva y como medida de resumen se usaron porcentajes (%) que son presentados en las tablas de resultados.

 

RESULTADOS

Control de viabilidad. Se encontró que el inóculo bacteriano de cada una de las cepas ATCC fue viable y se comportaron dentro de los recuentos de UFC establecidos en la escala nefelométrica de Mc Farland; éste inóculo en millones de UFC fue el que entró en contacto con el desinfectante.
Para evaluar los resultados se clasificaron en: Negativo, cuando hubo inhibición total del crecimiento bacteriano ó positivo cuando hubo presencia de bacterias medidas en UFC de microorganismos en las diferentes concentraciones y tiempos.

Bacterias Gram positivas. El HOCl tuvo una efectividad del 100% sobre S. sanguis y S. mutans a concentraciones iguales o superiores de 500 ppm al minuto de acción. A concentraciones de 125 y 250 ppm se requirieron 5 minutos para lograr inhibición total. Enterococcus faecalis mostró también una inhibición total a concentraciones = a 500 ppm a un minuto de acción del HOCL (Tabla 1).


Bacterias anaerobias. De acuerdo a los resultados observados para bacterias Gram positivas se probaron concentraciones = a 500 ppm. Para P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans, E. corrodens, C. rectus y F. nucleatum, el HOCl tuvo una efectividad del 100% a concentraciones iguales o superiores de 500 ppm al minuto de acción. (Tabla 2).


Microorganismos sobreinfectantes. El HOCl también mostró una efectividad del 100% a concentraciones iguales o superiores de 500 ppm al minuto de acción sobre E. cloacae, K. oxytoca y K. pneumoniae, bacterias sobreinfectantes de cavidad oral. A concentraciones más bajas se requieren tiempos más prolongados de acción. Contrariamente, el HOCl tuvo una efectividad del 100% a concentraciones iguales o superiores de 500 ppm a los 10 minutos de acción, 1000 y 1500 ppm a los 5 minutos sobre Cándida albicans. (Tabla 3)

 

DISCUSIÓN

El agente más ampliamente utilizado para la desinfección de la cavidad oral es la clorhexidina y su efecto sobre la inhibición de placa dental, reducción de caries y gingivitis ha sido bien documentado (17). Sin embargo, algunos efectos colaterales han desestimulado su uso clínico. Los efectos adversos incluyen: pigmentación dental, ya que se mezcla fácilmente con los cromógenos de la dieta; escasa actividad microbicida a bajas concentraciones y en altas concentraciones puede producir dermatitis; lesión de mucosas y resequedad de los tejidos, situación que altera y retrasa el proceso de cicatrización (8).

El hipoclorito de sodio ha sido utilizado en algunos estudios de inhibición de microorganismos subgingivales en bolsas periodontales. Slots en 2002, recomendó una solución de hipoclorito de sodio como irrigante subgingival en el mantenimiento periodontal, en una concentración de 0.1% o 1000 ppm de cloro disponible. Perova et al., en 1990 reportaron un efecto clínico importante con el uso de hipoclorito de sodio en irrigación subgingival en pacientes durante el mantenimiento periodontal y Lobene et al., en 1972 ya habían reportado que la irrigación subgingival con 0.5% de hipoclorito de sodio, (solución Dakin) causó mayor reducción de placa y gingivitis que la irrigación con agua. Sin embargo, el hipoclorito de sodio presenta algunos efectos colaterales que incluyen irritación de las membranas mucosas cuando se usa a altas concentraciones, efectos decolorantes y efectos corrosivos de algunos metales (4, 18, 19).

El ácido hipocloroso es el componente activo del hipoclorito de sodio sin sus efectos adversos, de esta manera, se podría considerar como un potente antimicrobiano para uso en cavidad oral ya que se ha demostrado su bajo poder de toxicidad, su efecto antimicrobiano y además, puede ser usado como un agente antibacteriano tópico para heridas, úlceras en piel y mucosas, sin inhibición de la actividad fibroblástica (2, 20).

En el presente estudio, se evaluó el efecto antimicrobiano del ácido hipocloroso sobre cepas con capacidad patogénica en la cavidad oral. Los resultados de esta evaluación, permitieron demostrar que a concentraciones de 500 ppm con un tiempo de acción de 1 minuto, se logró inhibir bacterias Gram positivas, anaerobias y sobre infectantes. Sin embargo, la efectividad del ácido hipocloroso sobre Candida albicans, logró un efecto inhibitorio a una concentración de 500 ppm después de 10 minutos y a una concentración de 1000 y 1500 ppm después de 5 minutos, mostrando bajo poder fungicida.

Los resultados reportados, muestran un efecto antimicrobiano potente y de amplio espectro para microorganismos asociados con caries dental, endocarditis infecciosa, sobreinfectantes y microorganismos del complejo naranja, que favorecen el crecimiento de microorganismos periodontopáticos del complejo rojo como P. gingivalis, T. denticola, T. forshytia y E. nodatum, asociados a la enfermedad periodontal (21), lo que hace del ácido hipocloroso, un antimicrobiano no antibiótico de alto interés en odontología. El efecto sobre microorganismos periodontopáticos del complejo rojo como P. gingivalis mostró una inhibición a concentraciones similares que otros microorganismos evaluados en el presente estudio.

Una ventaja importante del ácido hipocloroso es su acción contra microorganismos sobre infectantes como las enterobacterias, que parecen reducir la respuesta al tratamiento periodontal, a concentraciones similares que las requeridas para inhibición de otros microorganismos de la cavidad oral. Un bajo efecto de la clorhexidina sobre enterobacterias ha sido reportado previamente (22).

El efecto anti fúngico del ácido hipocloroso requiere un mayor tiempo de acción o un aumento en su concentración lo que no lo hace un agente anti fúngico efectivo a dosificación de 500 ppm.

Se concluye que el ácido hipocloroso es un buen bactericida ya que inhibió todas las cepas bacterianas empleadas en este estudio, siendo efectivo en un 100%, a concentraciones de 500 ppm y a un 1 minuto de acción sobre S. sanguis, S. mutans, P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans, E. corrodens, C. rectus, F. nucleatum, K. oxytoca, K. pneumoniae y E. cloacae. Además, el ácido hipocloroso posee una efectividad anti fúngica sobre Candida albicans a concentraciones > a 500 ppm.

 

AGRADECIMIENTOS

Al laboratorio Aquilabs Ltda.

 

REFERENCIAS

1. Palmer R. Oral bacterial biofilms - history in progress. Microbiology 2009 ;155(Pt 7):2113-4.

2. Slots J, Jorgensen MG. Effective, safe, practical and affordable periodontal antimicrobial therapy: where are we going, and are we there yet? Periodontol 2000. 2002; 28:298-312.

3. van der Weijden GA, Hioe KP. A systematic review of the effectiveness of self-performed mechanical plaque removal in adults with gingivitis using a manual toothbrush. J Clin Periodontol. 2005; 32 Suppl 6:214-228.

4. Slots J. Selection of antimicrobial agents in periodontal therapy. J Periodontol Res 2002; 37:389-398.

5. Quirynen M, Bollen CM, Vandekerckhove BN, Dekeyser C, Papaioannou W, Eyssen H. Full- vs. partial-mouth disinfection in the treatment of periodontal infections: short-term clinical and microbiological observations. J Dent Res 1995; 74:1459-67.

6. Bollen CM, Mongardini C, Papaioannou W, Van Steenberghe D, Quirynen M. The effect of a one stage full-mouth desinfection on different intra-oral niches. Clinical and microbiological observations. J Clin Periodontol 1998; 25:56-66.

7. Mongardini C, van Steenberghe D, Dekeyser C, Quirynen M. One stage full-versus partial-mouth disinfection in the treatment of chronic adult or generalized early-onset periodontitis. I. Long-term clinical observations. J Periodontol 1999; 70:632-645.

8. Jones CG. Chlorhexidine: is it still the gold standard? Periodontol 2000. 1997; 15:55-62.

9. Wang L, Bassiri M, Najafi R, Najafi K, Yang J, Khosrovi B, Hwong W, Barati E, Belisle B, Celeri C, Robson MC. Hypochlorous acid as a potential wound care agent: part I. Stabilized hypochlorous acid: a component of the inorganic armamentarium of innate immunity. J Burns Wounds. 2007; Apr 11: 65-79.

10. Weiss SJ. Tissue destruction by neutrophils. N Engl J Med 1989; 320:365-376.

11. Naranjo julio, Acevedo Cesar, Calderón Justo, Uso del Acido Hipocloroso en ulceras de miembros inferiores. Informador medico, 2006; 94: 8 – 11.

12. Gaitán Juan, Naranjo Julio, Saavedra Miguel Ángel, Calderón Justo Leonardo, Impacto del Hipocloroso sobre la heridas quirúrgicas de la apendicectomía. Informador medico, 2006; 6:12 – 14.

13. Henao Rivero Sandra, Sierra Claudia, Gaitán Juan., Actividad bactericida del ácido hipocloroso sobre 5 cepas causantes de infección nosocomial. Revista Universidad nacional de Colombia, 2002; 15: 136 – 142.

14. León CI, Pardo YP, Ramírez CX: Effect of some biocides on non- tuberculous mycobacteria. Biomédica 2002; 22:133-140.

15. Shimizu M, Okozumi K, Yoneyama A, Kunisada M, Ogawa H, Kimura S. In vitro antiseptic susceptibility of clinical isolates from nosocomial infections. Dermatology 2002; 204:21-27.

16. Janina P, Janet A, James C, David M, Francis l. Hemoglobinase Activity of the Lysine Gingipain Protease (Kgp) of Porphyromonas gingivalis W83. J Bacteriol 1999. 4905-4913.

17. Van Rijkom HM, Truin GJ, van 't Hof MA. A Meta-analysis of Clinical Studies on the Caries-inhibiting Effect of Chlorexidine Treatment. J Dent Res, 1996; 75:790-795.

18. Perova MD, Lopunova ZhK, Banchenko GV, Petrosian EA. A clinico-morphological assessment of the efficacy of sodium hypochlorite in the combined therapy of periodontitis. Stomatologiia (Mosk) 1990; 69:23-26.

19. Lobene RRR, Soparkar PM, Hein JW, Quigley GA: A study of the effects of antiseptic agents and a pulsating irrigating device on plaque and gingivitis. J Periodontol 1972; 43:564-568.

20. Robson MC, Payne WG, Ko F, Mentis M, Donati G, Shafii SM, Culverhouse S, Wang L, Khosrovi B, Najafi R, Cooper DM, Bassiri M. Hypochlorous Acid as a Potential Wound Care Agent. Part II. Stabilized Hypochlorous Acid: Its Role in Decreasing Tissue Bacterial Bioburden and Overcoming the Inhibition of Infection on Wound Healing. J Burns Wounds. 2007; 11:6:e6.

21. Haffajee AD, Socransky SS, Patel MR, Song X. Microbial complexes in supragingival plaque. Oral Microbial Immunol 2008; 23: 196-205.

22. Pannuti CM, Lotufo RF, Cai S, Saraiva Md Mda C, de Freitas NM, Falsi D. Effect of a 0.5% chlorhexidine gel on dental plaque superinfecting microorganisms in mentally handicapped patients. Pesqui Odontol Bras. 2003; 17:228-233.