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GENOTIPIFICACIÓN Porphyromonas gingivalis- fimA: ESTANDARIZACIÓN DEL MÉTODO
 

GENOTYPING Porphyromonas gingivalis - fimA: STANDARDIZATION METHOD

 

Sandra Morenoz1,4,
Beatriz Parra2,4
Adolfo Contreras3,4

 

1. Magister en Ciencias Biomédicas. Profesor auxiliar, Escuela de Odontología, Universidad del Valle  y Departamento de Ciencias básicas de la Salud, Pontificia Universidad Javeriana Cali. sandra.m.moreno@correounivalle.edu.co
2. PhD Molecular Microbiology And Immunology - University Of Southern California. Profesor, Departamento de Microbiología, Universidad del Valle. bparrap@yahoo.com
3. PhD Craniofacial Biology - University Of Southern California. Profesor Escuela de Odontología, Universidad del Valle. adolfoco@yahoo.com
4. Grupo de Investigación Medicina Periodontal

 

Recibido 11 de Abril 2014/Enviado para modificación 20 de Abril 2014/Aceptado 25 de Abril 2014

 

RESUMEN

Objetivo. Optimizar la técnica de PCR convencional para la identificación de los diferentes genotipos del gen fimA de Porphyromonasgingivalis.  Métodos. Se cultivaron las cepas de Porphyromonas gingivalis ATCC 33227, W83, y ATCC33279,  y aislados clínicos 486 y 723. Se realizó extracción de ADN y se realizó la PCR convencional, con diferentes condiciones de astringencia, (concentración de MgCl2), y diferentes grados de temperatura de alineación. La sensibilidad se calculó teniendo en cuenta el número de bacterias en diferentes diluciones. La especificidad de los primers utilizados fue calculada.Resultados. Los mejores resultados se obtuvieron con una concentración de 2 mM de MgCl2 y una temperatura de alineación de 60°C. En cuanto a la sensibilidad se encontró diferencias entre las muestras recuperadas del cultivo puro y las muestras inoculadas en fluido gingival crevicular, aumentando 10 veces el límite de detección. Se observó una alta especificidad entre los  primers y las secuencias de las cepas. Conclusión. En la prueba de PCR convencional, las condiciones óptimas son la concentración de 2 mM de MgCl2  y 60°C de temperatura de alineamiento, se puede inferir que los primers son secuencias específicas para la amplificación de los genotipos de fimA de P. gingivalis, cuando se toman muestras subgingivales es necesario una carga bacteriana mínima de 500 células para poderlos identificar.

Palabras clave: Reacción en cadena de la Polimerasa; Genotipificación; Porphyromonas gingivalis; fimbrias.

 

ABSTRACT
 
Objective. To optimize conventional PCR technique for the identification of the different genotypes fimA gene from Porphyromonas gingivalis. Methods. We cultured strains of Porphyromonas gingivalis ATCC33227, W83, and ATCC33279, and 486 and 723 clinical isolates. DNA extraction was performed and conventional PCR was performed with different stringency conditions (concentration of MgCl2), and different temperatures alignment. Sensitivity was calculated by considering the number of bacteria in different dilutions. The specificity of the primers used was calculated. Results. The best results were obtained with a concentration of 2 mM MgCl2 and a temperature of 60 ° C. alignment As to the sensitivity differences were found between the samples recovered from the pure culture and inoculated samples in gingival crevicular fluid, increasing 10 times the limit of detection. High specificity was observed between the primers and the sequences of the strains. Conclusions. In the conventional PCR test, optimal conditions are the concentration of 2 mM MgCl2 and 60 ° C annealing temperature, it can be inferred that the primers are specific sequences for amplification of fimA genotypes of P. gingivalis, when sampling is required subgingival bacterial load of at least 500 cells to be able to identify.

Key words: Polimerase chain reaction; Genotipification; Porphyromonas gingivalis; fimbriae.

 


INTRODUCCIÓN

La Periodontitis es una enfermedad multifactorial que se desencadena por la formación de la biopelícula alrededor del margen de la encía, (1, 2) lo cual induce una respuesta inflamatoria crónica que conlleva  a la pérdida de tejido conectivo y hueso alveolar, (3,4) debido a la gran cantidad de mediadores químicos secretados(5). Porphyromonas gingivalis es un coco-bacilo Gram-negativo, anaerobio que ha sido asociado al inicio y progresión de la enfermedad periodontal crónica y agresiva (6-8).

Cuenta con una gran cantidad de factores de virulencia, que le permiten la colonización  y supervivencia en el ambiente subgingival (9,10). Dentro de sus factores de virulencia se encuentran las fimbrias, que son finos y numerosos apéndices adheridos a la membrana externa de la pared celular (7). P. gingivalis cuenta con dos tipos de fimbrias, las fimbrias menores y las fimbrias mayores. Las primeras han sido asociadas al proceso de colonización (11), las últimas se han relacionado con adhesión e incluso invasión dentro de las células epiteliales de la encía, fibroblastos y monocitos (12-14). Estas fimbrias están conformadas por subunidades de fimbrillina, que está codificada por el gen fimA del cual se conocen 6 genotipos, del I al V yIb, deacuerdo a la secuencia de nucleótidos (4, 7, 15).

La variabilidad genotípica entre los aislados de P. gingivalis es un reflejo de las distintas secuencias en su ADN, por ese motivo los métodos moleculares de tipificación han sido un gran aporte para su estudio (8). En la literatura, es posible encontrar varios estudios que han determinado la prevalencia de fimA en diferentes poblaciones, como Japón (12, 16 - 21), China (22 - 24), Alemania (25), Noruega (26), Estados Unidos, Indonesia, Canadá, Suiza, Noruega, Suecia, Kenia, Francia, Finlandia y Holanda (14), Brasil (7, 27), Mexico (28), Chile (29) y Colombia (30). Los resultados de estos estudios han mostrado que los genes fimAII y fimA IV  son los más frecuentes en pacientes con periodontitis, mientras que en sujetos sanos se ha encontrado mas relacionado los genes fimA I y III; sin embargo se han encontrado ciertas diferencias entre poblaciones como Brasil (7, 27), México (28) y Chile (29).

Aunque existen diferentes métodos moleculares para el análisis microbiológico (31), la PCR convencional ha sido el más utilizado para el estudio de la prevalencia y distribución de los genotipos de fim A de Porphyromonas gingivalis en pacientes con diferentes estadios de la enfermedad periodontal alrededor del mundo (15, 17, 41, 44-49, 52, 54, 55). Sin embargo la sensibilidad analítica de la técnica ha sido estandarizada a partir de la identificación de secuencias de ADN representativas del gen rRNA 16S bacteriano y el gen específico para cada genotipo, utilizando las cepas de laboratorio, cultivadas y purificadas, pero en la investigación y en la práctica clínica, la detección de estos genes es realizada a partir de aislados clínicos obtenidos de fluido gingival crevicular, el cual contiene multiples especies bacterianas, integrantes de la biopelicula, las cuales pueden sintetizar diferentes enzimas como DNasas, RNasas y bacteriocinas que pueden enmascarar la identificación de las secuencias que se quiere buscar, según el propósito de cada estudio.

El objetivo de éste estudio fué optimizar la técnica de PCR convencional para la identificación de los diferentes genotipos del gen fimA de Porphyromonas gingivalis.


MATERIALES Y MÉTODOS

Cepas de P. gingivalis y cultivos
Las cepas de P. gingivalis: ATCC33227 (FimA I), W83 (FimA IV), y ATCC33279 (FimAIb),  y los aislados clínicos número 486 (FimA II) y 723 (FimA III), se cultivaron en agar sangre de cordero suplementado con hemina y menadiona marca Sigma  por la técnica de dispersión en agar, e incubado en anaerobiosis a 37˚C por 15 días, empleando anaerogen, marca Oxoid, para anaerobiosis.

Extracción de ADN
Se realizó extracción de ADN por Silica, Boom 1989 (32). Se adicionaron 300 µL de buffer TE en cada eppendorf con las puntas de papel, se dejaron en vortex por 10 minutos. Por cada muestra se preparó un vial de reacción con 800 microlitros de buffer L6 (120 gr. Thyocianato de Guanidina + 90 ml TRIS HCl pH 6.4 + 22 ml de EDTA pH 8.0 y 2,8 ml Triton x-100) 40 microlitros de silica y se mezclaron. Se agregaron 300 µL de la muestra en el vial de reacción, homogenizando en vortex por 10 segundos, se dejó reposar a temperatura ambiente por 10 minutos y se homogenizó nuevamente por 10 segundos en vortex. Se centrifugó a 11.300 rpm por 30 segundos, después se eliminó el sobrenadante y se lavó el precipitado con 800 µL de buffer L2 (120 gr. Thyocianato de Guanidina + 100 ml TRIS HCl pH 6.4), homogenizando con vortex hasta desprender el precipitado y centrifugar a 11.300 rpm por 30 segundos, después se eliminó nuevamente el sobrenadante y se repitieron los pasos anteriores hasta obtener un precipitado limpio. Se adicionó etanol al 70%, se homogenizó en vortex hasta desprender el precipitado, se centrifugó (11.300 rpm) por 30 segundos, luego se eliminó el sobrenadante.  Posteriormente se adicionaron 800 µL de acetona, se homogenizó en vortex  y se centrifugó (11.300 rpm) por 30 segundos, eliminándose el sobrenadante. Los tubos se dejaron destapados en el bloque de calor a 56°C  durante 10 minutos, una vez transcurrido el tiempo se le adicionaron 200 µL de buffer TE y se expusieron nuevamente al calor a 56°C  por 10 minutos, después de haber homogenizado con vortex. Por último se centrifugó a 11.300 rpm por 2 minutos, y el ADN extraido fue almacenado, debidamente rotulados, a -20ºC  hasta su procesamiento  (32).

Optimización de la astringencia y temperatura de alineamiento de la PCR para el gen fimA de P. gingivalis.

Para determinar la concentración de MgCl2 y la temperatura de alineamientoóptimas para la obtención de amplificados en la prueba, se realizó el procedimiento con diferentes concentraciones de MgCl2 (1 mM, 1,5 mM y 2.0 mM) y dos temperaturas de alineamiento: 60°C y 55°C.

Sensibilidad del PCR para el Gen fimA de P. gingivalis.
Para determinar el límite de detección del gen fimA de Porphyromonasgingivalis, Se realizó el método de Mc Farland, escala0.5, a partir del cultivo,  para obtener una concentración de 1x 108 células bacterianas y a partir de ésta concentración se hicieron 3 diluciones al límite en agua mq por duplicados, basados en la metodología de Amano et al 1999 (17). Se obtuvieron las siguientes concentraciones finales:5 x 103  / 5 µL, 5 x 102  / 5 µL, 5 x 10  / 5 µL. De las diluciones previas, se tomaron muestras con puntas de papel estériles a las cuales se les realizó la extracción de ADN directamente, y de las diluciones duplicadasse inocularon experimentalmente en un eppendorf que contenía puntas de papel con fluido gingival crevicular (FGC) obtenido de pacientes negativos para P. gingivalis, para determinar que tanta inhibición le otorga este fluido a la detección de los genotipos de fimA. Posteriormentese realizó extracción de ADN. Se incluyeron controles de extracción negativos (puntas de papel estériles inmersas en buffer TE) y controles positivos (puntas de papel con fluido gingival crevicular de pacientes positivos para P. gingivalis).  Se realizó la PCR con todas las muestras con dos concentraciones de MgCl2 (1,5 y 2,0) y dos temperaturas de alineamiento (55 y 60°C). Por último se tomaron 5 µL de cada dilución y se cultivaron en agar sangre de cordero suplementado con hemina y menadiona, por la técnica antes descrita, para, finalmente,  contar las UFC (Unidades Formadoras de Colonias) de P. gingivalis en cada una de ellas.

Especificidad de la PCR para el Gen FimA de P. gingivalis.
Para determinar la especificidad de los primers de los diferentes genotipos de FimA de P. gingivalis, se realizó la PCR según las condiciones de astringencia y temperatura de alineamiento, previamente estandarizada, con los primers ubicuos bacterianos (primers que amplifican un segmento del gen rRNA 16S bacteriano), primers específicos para P. gingivalis (primers que amplifican un segmento del gen rRNA 16S de P. gingivalis), y los primers específicos para cada genotipo fimA I, II, II, IV y Ib, (Tabla 3), utilizando como muestras el ADN de las cepas de P. gingivalis  ATCC33227(FimA I), W83 (FimA IV), y ATCC33279 (FimAIb),  y de los aislados clínicos número 486 (FimA II) y 723 (FimA III). Las cepas de A. actinomycetencomitans (D11-s1), T. denticola (ATCC. 43056)  y T. forsythia (ATCC 43037). Las secuencias se obtuvieron de los estudios de Amano et al. 1999 (17), Amano et al. 2000 (20), Missailidis et al. 2004 (27), Texeira et al. 2008 (7), Davila et al. 2009 (28).

 

RESULTADOS

Optimización de la astringencia y Temperatura de alineamiento de la PCR para el gen fimA de P. gingivalis.

Temperatura de alineación 55°C.
Se observaron bandas positivas en concentraciones de 1 mM, 1,5 mM y 2.0 mM a 55°C de temperatura.Las mejores bandas fueron observadas a concentraciones de 1,5 y  2 mM de MgCl2, en este rango de temperatura de alineación.

Temperatura de alineación 60°C.
Se observaron bandas positivas en concentraciones de 1,5 y 2.0 mM a 60°C   de temperatura.No se observan bandas en la concentración de 1.0 mM de MgCl2 a 60 grados.Las mejores bandas fueron observadas a concentraciones de 2 mM de MgCl2, en este rango de temperatura.

Sensibilidad del PCR para el Gen fimA de P. gingivalis.
Los resultados se presentan en la tabla 1, encontrando que el límite de detección de las diluciones sin inocular en FGC fue de 50 células, mientras que las diluciones inoculadas en FGC tuvieron un límite de detección 10 veces mayor, correspondiente a 500 células.

Resultados de la Prueba de Sensibilidad del PCR para determinar el límite de detección del gen fimA de P. gingivalis. D1(Dilución 1-5 x 103  / 5  µL), D2 (Dilución 2-5 x 102 / 5  µL), D3 (Dilución 1-5 x 10 / 5  µL) D1(SP) (Dilución 1-5 x 103  / 5  µL  no inoculada en puntas de papel ), D2(SP) (Dilución 2-5 x 102 / 5  µL  no inoculada en puntas de papel), D3(SP) (Dilución 1-5 x 10 / 5  µL  no inoculada en puntas de papel)

 

En la Tabla 2 y figura 1, se presentan los resultados de las CFU, según la lectura de los cultivos realizados a partir de las tres diluciones: D1(Dilución 1-5 x 103  / 5 µL), D2 (Dilución 2-5 x 102 / 5 µL), D3 (Dilución 1-5 x 10 / 5 µL), en agar sangre de cordero  suplementado con hemina y menadiona, incubados por 15 días a 37 ˚C en condiciones de anaerobiosis. Se realizaron duplicados de la prueba.

Resultados  que muestran el número real de CFU (Unidades Formadoras de Colonias) en los cultivos de P. gingivalis, cepa W 83 (FimA IV), sin diluir y en las tres diluciones: D1 (Dilución 1-5 x 103  / 5  µL), D2 (Dilución 2-5 x 102 / 5  µL), D3 (Dilución 1-5 x 10 / 5  µL).

 

Fig. 1.  Diferencias en el número de CFU en cada uno de los cultivos. A(cepas de P.g. sin diluir), B (D1), C(D2), D (D3), E (diferencias en la cantidad de CFU en orden desde la no diluida hasta la más diluida).


Especificidad de la PCR para el Gen FimA de P. gingivalis.

Los resultados se presentan en la Tabla 3. Nosotros encontramos una alta especificidad de las secuencias de los primers con cada una de las cepas representativas de cada genotipo.

(+) Amplificación positiva; (-) No amplificó productos de PCR. I – IV y Ib (genotipos de FimA); P.g. (primers especie específicos del gen 16S rRNA); U,(primers bacterianos Universales para el control positivo. A. a. (Aggregatibacteractinomycetemcomitans), T.d. (Treponema denticola), T.f. (Tanerellaforsythia).

DISCUSIÓN

Teniendo en cuenta que la técnica de PCR convencional es una de las más sensibles y ampliamente utilizadas, es importante optimizarla y estandarizarla para mejorar la confiabilidad de los datos obtenidos. La PCR permite amplificar secuencias específicas del DNA, para identificar genes en diferentes tipos de muestras, ya sea a partir de sangre, saliva, muestras tisulares, biopsias, o como en este caso, muestras de fluido gingival crevicular. Dada esa alta sensibilidad, es posible que se obtengan resultados falsos positivos o falsos negativos, cuando las condiciones de la prueba no se han optimizado y adaptado al tipo de muestra con la cual se está trabajando. Otro factor importante a tener en cuenta es que la PCR convencional solo puede determinar la ausencia/presencia del gen, no es posible cuantificar la cantidad de este en la muestra, lo cual puede considerarse como una limitación de la técnica, y por esta razón es importante controlar todas las variables para evitar que sean tomadas como positivas las amplificaciones de genes diferentes al objetivo de investigación.

Optimización de la astringencia y Temperatura de alineamiento de la PCR para el gen fimA de P. gingivalis.

En el ensayo de optimización realizado en el laboratorio de Microbiología Oral de la Universidad del Valle, los mejores amplificados del gen fimA de Porphyromonas gingivalis fueron obtenidos cuando se trabajó con una concentración de MgCl2 de 2 mM y una temperatura de alineamiento de 60°C. Los diferentes estudios de genotipificación publicados en la literatura refieren el protocolo del PCR utilizado en su metodología, Amano et al., en 1999 (17), Missailidis et al., en 2004 (27), Davila et al., en 2007 (28), Pérez–Chaparro et al., en 2009 (30), Hayashi et al., en 2012 (33) y Puig-Silla et al., en 2012 (34) reportan una temperatura de alineamiento de 58°C, mientras que Fabrizi et al., en 2013 (35) y Hoi-Moon et al., en 2011 (36) trabajaron con una temperatura de alineamiento de 55°C. Tanto los autores que manejaron la temperatura de alineamiento de 58°C, como los que trabajaron con 55°C, expresaron la veracidad y especificidad en sus resultados, teniendo en cuenta el uso de controles positivos y negativos en sus experimentos. En los ensayos realizados para el presente estudio, se evidencian bandas tanto a 55°C, como a 60°C, siendo mas fluorescentes, en ésta última temperatura. Teniendo en cuenta nuestros resultados y los de los trabajos previos se puede considerar que el intervalo de 55-60°C, es óptimo para la obtención de amplificados del gen fimA de P. gingivalis, siendo mucho mejor, para las condiciones de trabajo de nuestro laboratorio, la temperatura de 60°C, debido a que habiendo obtenido una banda mas nítida, permite identificar los genotipos en las muestras que tengan una baja carga bacteriana, y que con temperaturas más bajas puede dar resultados falsos negativos.

Con respecto a la concentración de MgCl2, en el ensayo se trabajaron 3 concentraciones diferentes (1mM, 1,5mM y 2mM) para determinar la que mejor astringencia le brindara a la genotipificación, identificando las mejores bandas con una concentración de 2 mM. En los trabajos previos de Amano et al., (17, 20), quien ha sido el pionero en la genotipificación de P. gingivalis, no se reportan las concentraciones de MgCl2  utilizadas, Missailidis et al., en 2004 (27) y Puig-Silla et al., en 2012 (34), reportan en su protocolo una concentración de 3mM, mientras que Perez-Chaparro et al., en 2009 (30) también trabajaron con una concentración de 2 mM.

Sensibilidad dela PCR para el Gen fimA de P. gingivalis.
Nuestro límite de detección de los genotipos de fimA de Porphyromonas gingivalis fue de 50 células bacterianas, muy similar a lo reportado por Amano et al., en 1999 (26), quienes realizaron la misma metodología, identificando los genotipos a partir de diluciones al límite desde un cultivo puro. Al realizar la misma prueba apartir de las diluciones inoculadas en FGC de pacientes negativos para P. gingivalis, el límite de detección aumentó a 500 células bacterianas, este resultado puede ser debido a la presencia de enzimas presentes en el FGC teniendo en cuenta que la periodontitis es una infección multi-especie.

Las diluciones de P. gingivalis (5 x 103, 5x 102, 5 x10) fueron cultivadas en agar sangre, lo cual también fue una modificación del experimento citado por Amano et al., 1999 (17). En el cultivo se encontraron diferencias en cuanto al número de CFU que crecieron en las tres diferentes diluciones, encontrando en la última dilución de 5 x 10/ 5 µL, un crecimiento de solo 4 CFU. Estos resultados muestran que el límite de detección del PCR para las diluciones inoculadas en puntas de papel, corresponde a 500 células y esta concentración equivale a 81 CFU de P. gingivalis en cultivo (tabla 2- Fig. 1).   

Especificidad de la PCR para el Gen fimA de P. gingivalis.
La especificidad de la técnica de PCR también fue analizada y se basó en la técnica de Amano et al., en 1999. (17) Con éste experimento se comprobó la especificidad de los primers, lo cual aseguró que solo se amplifican las secuencias de cada genotipo (tabla 3).

 

Conclusiones

Teniendo en cuenta la variabilidad genotípica entre los aislados de P. gingivalis, los métodos moleculares de tipificación han sido un gran aporte para su caracterización, es por esto que se hace indispensable estandarizar la técnica con el fin de optimizarla y evitar falsos positivos y/o falsos negativos. En el laboratorio de Microbiología Oral de la Universidad del Valle, se realizó la estandarización del método encontrando que las condiciones mas óptimas son la concentración de 2 mM de MgCl2  y 60°C de temperatura de alineamiento, y se puede inferir que aunque los primers son secuencias muy especificas para la amplificación de los genotipos de fimA de P. gingivalis, cuando se toman muestras subgingivales es necesario que el paciente tenga una carga bacteriana mínima de 500 células para poder identificar dichos genotipos.


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