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HERPESVIRUS Y BACTERIAS PERIODONTOPÁTICAS EN PREECLÁMPTICAS CON PERIODONTITIS.

HERPESVIRUSES AND PERIODONTOPHATIC BACTERIA IN PREECLAMPTICS WITH PERIODONTITIS.

Santiago Vélez-Medina1
Anilza Bonelo2
Julian Alberto Herrera3
Beatriz Parra2
Adolfo Contreras4

 

1 Profesor Auxiliar – Departamento de Microbiología, Escuela de Ciencias Básica, Universidad del Valle – Cali – Colombia
2 Profesores Asistentes – Departamento de Microbiología, Escuela de Ciencias Básicas, Universidad del Valle – Cali – Colombia
3 Profesor titular – Escuela de Medicina, Universidad del Valle – Cali – Colombia
4 Profesor Titular – Escuela de Odontología, Universidad del Valle – Cali – Colombia


Recibido 30 de Noviembre 2013/Enviado para modificación 19 de Diciembre 2013/Aceptado 29 de Diciembre 2013

 

RESUMEN

Objetivo. Determinar la condición periodontal y microbiota subgingival (5 bacterias y 3 herpesvirus) en 56 preeclámpticas con gingivitis y periodontitis.   Métodos. El diagnóstico periodontal se hizo según los criterios de la AAP 1999. La identificación de la microbiota subgingival se hizo por reacción en cadena de la polimerasa y los niveles de proteína C-reactiva se determinaron por pruebas de quimioluminiscencia. Resultados. La gingivitis y la periodontitis fueron condiciones prevalentes en las pacientes, desde que no se encontraron preeclámpticas periodontalmente sanas. Porphyromonas gingivalis y Prevotella intermedia fueron frecuentes en preeclámpticas con periodontitis vs gingivitis Prueba de Chi-Cuadrado p ≤ 0.05 como significancia estadística (p=0,001 and p=0,039 respectivamente). Los niveles de Proteína C-reactiva fueron mayores en preeclámpticas con periodontitis que en preeclámpticas con gingivitis. Conclusiones. La enfermedad periodontal sin tratamiento, incluyendo la gingivitis fue prevalente en preeclámpticas. Porphyromonas gingivalis y Prevotella intermedia fueron microorganismos subgingivales prevalentes en pacientes con periodontitis. No se encontraron diferencias significativas en la presencia de Herpesvirus entre los grupos. Citomegalovirus fue el herpesvirus más prevalente, seguido por  Epstein Barr virus y Herpes Simple virus. Programas de cuidado oral son necesarios para reducir el impacto de las infecciones e inflamaciones orales durante el embarazo.

Palabras clave:
preeclampsia; periodontitis; bacterias periodontopáticas; herpesvirus; proteína C reactiva.

ABSTRACT

Objective. The aim of this descriptive study is to determine the periodontal condition, and the subgingival microbial composition (5 bacteria and 3 herpesviruses) in 56 women with preeclampsia. Methods. Periodontal diagnosis followed AAP 1999 diagnostic criteria. Subgingival microbial identification was made by polymerase chain reaction (PCR) and C reactive protein level was determined using chemioluminiscent assay.  Results. Gingivitis and periodontal disease resulted prevalent in preeclamptics since no periodontally healthy women were identified. Porphyromonas gingivalis and Prevotella intermedia were more frequent in subjects with periodontitis than in gingivitis Chi Square test P≤ 0.05 as statistical significance (p=0,001 and p=0,039 respectively). Serum hs-CRP values were higher in preeclamptics with periodontitis than in preeclamptics with gingivitis.  
Conclusions. Untreated gingivitis and periodontal disease was prevalent in this population. Porphyromonas gingivalis and Prevotella intermedia are prevalent subgingival microorganisms in preeclamptics with periodontitis. HCMV was the most prevalent herpesvirus, followed by EBV and HSV, however differences between gingivitis and periodontitis groups were not significant. Oral care programs might be necessary to reduce the impact of oral infection and oral inflammation in preeclamptics. 

Key words: preeclampsia; periodontitis; periodontophatic bacteria; herpesviruses; C reactive protein.


INTRODUCCIÓN


La preeclampsia es una condición exclusiva de la gestación humana, contribuye con el 42%de la mortalidad materna y perinatal, y es la primera causa de las restricciones de crecimiento intrauterino, parte pretérmino y bajo peso al nacer (1, 2). La preeclampsia se caracteriza por hipertensión y proteinuria, afecta del 3-5% de los embarazos a nivel mundial. Aunque la preeclampsia ha sido estudiada por largo tiempo, su etiología aún es desconocida, pero una de las condiciones relacionadas con la enfermedad son las infecciones no tratadas y la inflamación subclínica. 
La enfermedad periodontal es un proceso inflamatorio destructivo crónico disparado por las infecciones y el sobrecrecimiento de bacterias periodontopáticas gram negativas en el ambiente subgingival. Esta se asemeja a una infección crónica que expone al hospedero a una amplia gama de factores de virulencia y antígenos microbianos por largos periodos de tiempo (3).
Reportes previos han mostrado que una mala higiene oral se relaciona con parto pretérmino (4,5) y que mujeres, que durante el embarazo desarrollan preeclampsia presentan más periodontitis que mujeres con embarazos normales (6).
Por esta razón, es posible plantear la hipótesis que la mala higiene oral es un factor de riesgo para el desarrollo de complicaciones durante el embarazo como ruptura de membranas, parto pretérmino y preeclampsia (4).
Recientemente no solamente las bacterias se han relacionado con la enfermedad periodontal, sino también los herpesvirus se han asociado con gingivitis y periodontitis (7), sin embargo reportes de herpesvirus en preeclampsia son desconocidos.
La disfunción endotelial es una de las características durante la preeclampsia, pero no es claro si esta condición es la causa ó una consecuencia de la preeclampsia. Las preeclámpticas presentan un estado de inflamación comparadas con embarazos normales, lo cual se ha asociado con un aumento en la producción de citoquinas como IL-6 y TNF-a, y la proteína C reactiva (CRP) (8,9), consecuentemente, infecciones no tratadas se han relacionado con el aumento de riesgo de preeclampsia.
Este estudio descriptivo determinó la condición periodontal, y la composición de la microbiota subgingival en 56 mujeres con preeclampsia.

MATERIALES Y MÉTODOS

Mujeres embarazadas diagnosticadas con preeclampsia que asistieron al Hospital Universitario del Valle (HUV), fueron invitadas a participar en el estudio. El estudio siguió las normas éticas de la resolución 008430 de 1993 del Ministerio de Salud de Colombia y los principios de la declaración de Helsinki para la protección de sujetos humanos-2000.
Este proyecto fue aprobado por el Comité Institucional de Revisión de Ética Humana de la Universidad del Valle y del Hospital Universitario del Valle. Los datos sociodemográficos, obstétricos y periodontales fueron determinados en cada paciente. Cada sujeto firmó un consentimiento informado escrito antes de la inclusión.

Sujetos y examen clínico


Cincuenta y seis mujeres embarazadas que tenían entre 26 y 34 semanas de gestación diagnosticadas con preeclampsia leve entre Junio de 2006 y Junio de 2008 fueron invitadas a participar, las características de la población estudiada se especifican en la referencia (32). La preeclampsia leve fue definida como una presión sanguínea sistólica >140 ˂160 mmHg y una presión sanguínea diastólica >90 ˂110 mmHg, y teniendo 300 mg/L de proteínas en orina de 24 horas. La Preeclampsia severa incluye presión sanguínea sistólica sobre 160 mmHg, dolor de cabeza, visión borrosa, epigastralgia, fosfenos, tinitus, pruebas hepáticas alteradas, LDH alterado y trombocitopenia (10). Las pacientes con preeclampsia severa o compromiso fetal (restricción del crecimiento intrauterino-IGRU u oligohidramnios) fueron excluidas del estudio, también fueron excluidas embarazadas con un periodo de gestación menor a 26 semanas ó con más de 34 semanas de gestación, que hayan consumido antibióticos, y/o hayan tenido intervención periodontal 6 meses antes de la inclusión al estudio, con previa hipertensión, enfermedades renales y cardiovasculares o VIH. 
Muestras subgingivales y muestras de sangre total fueron tomadas al momento de la inclusión. El número de dientes y los parámetros clínicos periodontales fueron medidos. Los terceros molares fueron excluidos de la evaluación periodontal desde que la erupción no es adecuada y puede interferir con las medidas. Los datos periodontales fueron obtenidos por periodoncistas entrenados. La profundidad de las bolsas fue determinada midiendo la distancia entre la margen gingival y el fondo de la bolsa gingival, y el nivel de inserción clínica fue determinado midiendo la distancia entre la línea de esmalte-cemento hasta el fondo de la bolsa periodontal en seis sitios alrededor del diente. El sangrado gingival fue determinado como positivo si ocurría 15 segundos después de la prueba periodontal, y se reportó como el porcentaje de sitios sangrados. El diagnóstico periodontal fue establecido de acuerdo al reporte consenso de la Academia Americana de Periodontología (11). En cada paciente, los 4 surcos más profundos PD fueron escogidos. Para las muestras subgingivales una punta de papel (N° 45) fue insertada por 20 segundos dentro del sitio a muestrear, previa eliminación de la placa subgingival. Las puntas de papel fueron almacenadas en tubos Eppendorf estériles a -80°C hasta la extracción de ADN para la identificación de la presencia de DNA bacteriano y viral.  
Por otra parte, 2 tubos de sangre completa se tomaron para la obtención de muestras de suero para la determinación de la proteína C ultrasensible (hs-CRP), el suero fue almacenado a -80°C hasta la determinación (12, 13).

Detección de DNA bacteriano, viral y determinación de CRP ultrasensible.

La extracción de ADN se realizó de acuerdo a Boom et al (14). Brevemente, 300 ml de buffer TE (10 mM Tris-hydrochloride y 1 mM EDTA, pH 7,5) fue adicionado a un vial de microcentrífuga que contenía las puntas de papel de cada paciente y se mezcló en vortex por 10 minutos. Los ácidos nucleicos se unen a las partículas de sílica en la presencia de un buffer de lisis de tiocinato de guanidina (GuSCN). Cada muestra se incubó a 56°C por 10 minutos y se centrifugó a 12.000 por 2 minutos; el supernadante se almacenó a -80°C. La PCR se desarrollo para determinar la presencia de ADN bacteriano y viral.   
El PCR para las bacterias P. gingivalis (Pg), T. forsythia (Tf), Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa) and P. intermedia (Pi) se realizó de acuerdo a Saiki y Ashimoto (15, 16) usando un RNA ribosomal 16S. Las bacterias fueron identificadas por la presencia de un producto amplificado que de acuerdo a la especie tenían un peso molecular: P. gingivalis 404 pb, A. actinomycetemcomitans 557 pb, T. forsythensis 641 pb, P. intermedia 575 pb. Los productos de amplificación de la PCR se observaron en un transiluminador bajo luz ultravioleta (300 nm).
 La presencia de Herpesvirus, Citomegalovirus (CMV), Herpes Simple (HSV-1) y Epstein Barr (EBV) fue determinada usando una técnica de PCR anidado descrita por Parra y Slots (7). Los herpesvirus fueron identificados por la presencia de un amplicor: CMV 136 pb, HSV 222 pb and EBV 497 pb. La determinación de los niveles de hs-CRP se realizó en muestras de suero usando un ensayo comercial inmunométrico de quimioluminiscencia (IMMULITE 1000 Diagnostic Products Corporation DPC). 

Análisis Estadístico


Los datos sociodemográficos y parámetros clínicos son presentados como la media ± SD. Diferencias en parámetros clínicos entre grupos fueron establecidos por la prueba de doble cola de Student. La frecuencia de Herpesvirus y bacterias periodontopáticas fue determinada por la prueba de chi cuadrado (Chi2). Los datos se analizaron usando el software estadístico SPSS versión 2.6 y el software Epistat versión 3.0. Se asumió significancia estadística cuando p ≤0.05.

RESULTADOS

Cincuenta y seis mujeres embarazadas con preeclampsia leve fueron evaluadas, 16 mujeres presentaron gingivitis (28,6%) mientras que 40 periodontitis (71,4%). No hubo pacientes periodontalmente sanas. Las características demográficas y clínicas de las pacientes se muestran en la tabla 1. La mayoría de las pacientes fueron jóvenes 23,38 ± 6,9 para el grupo gingivitis y 25,15± 6,9 para el grupo periodontitis. El parto por cesárea se realizó en la mayoría de las pacientes. Parto a término de 37-39 semanas se presentó en el 12,5% (n=2) del grupo gingivitis y en el 22,5% (n=9)  del grupo periodontitis. El peso de los recién nacidos de madres con gingivitis estuvo entre los 1300 a 3560 gr, y en el grupo periodontitis entre 1050 a 3200 gr (p=0,96). Los rangos de hs-CRP fueron 1,55 – 39,35 mg/L para el grupo gingivitis y de 0,05 – 74,05 mg/L para grupo periodontitis. El promedio de hs-CRP fue de 9,09 mg/L en gingivitis comparado con 10,80 mg/L del grupo periodontitis.

Las pacientes con periodontitis tuvieron mayor profundidad del sondaje (PD) y pérdida de la inserción clínica (CAL) comparadas con el grupo gingivitis (p=0,02 y 0,001, respectivamente). El sangrado al sondaje (BOP) fue del 10,14% para el grupo gingivitis y del 19,4% para el grupo periodontitis (p=0,05) tabla 2.

Las bacterias del complejo rojo fueron frecuentes en periodontitis comparados con gingivitis. Tannerella forsythia se detectó en 12 (75%) del grupo gingivitis y en 37 (92,5%) del grupo periodontitis (p=0.074), Porphyromonas gingivalis estuvo presente en 8 (50%) y 37 (92,5%) pacientes del grupo gingivitis y periodontitis respectivamente (p=0,00). A. actinomycetemcomitans fue la bacteria menos frecuente presente en las muestras subgingivales de las pacientes, 3 (18,75%) de las preeclámpticas con gingivitis y en 12 (30%) de las preeclámpticas con periodontitis (p=0,39), y Prevotella intermedia se detectó en 6 (37,5%) de las pacientes con gingivitis y en 27 (67,5%) de las preeclámpticas del grupo periodontitis (p=0,039), tabla 3.

No hubo diferencias estadísticamente significativas en la presencia de Herpesvirus entre los grupos gingivitis y periodontitis. Citomegalovirus fue el virus más frecuente, 7 pacientes (43,75%) en el grupo gingivitis y 19 (47,5%) en el grupo periodontitis, EBV se detectó en 4 (24%) y en 11 (27,5%) de los grupo gingivitis y periodontitis respectivamente, y el virus menos frecuente fue HSV, este se encontró en 2 (12,5%) del grupo gingivitis y en 3 (7,5%) del grupo periodontitis, tabla 3.


DISCUSIÓN

Los resultados de este estudio confirman que la enfermedad periodontal es una condición frecuente en preeclampsia como se ha reportado previamente (1, 9, 17).
La enfermedad periodontal es una infección crónica que afecta la mucosa y el tejido conectivo que rodea y soporta los dientes. Esta condición se desarrolla por la acumulación de una biopelícula oral donde se presenta un aumento de antígenos y sobrecrecimiento bacteriano, originando gingivitis (18). Esta inflamación está mediada por la activación de células y moléculas del sistema inmune, tanto de la respuesta inmune innata y adaptativa, las cuáles se activan contra los estímulos inducidos por los microorganismos orales. La gingivitis crónica no controlada puede originar una peor manifestación, periodontitis, en la cual el desequilibrio de la homeostasis del tejido conectivo, hueso y tejido periodontal son observadas, llevando a la pérdida de piezas dentales.

Las preeclámpticas incluidas en el estudio comparten la presencia de microorganismos periodontopáticos y presentan características sociodemográficas similares, pero no mostraron idéntica condición clínica periodontal. Ninguna de las preeclámpticas incluidas en el estudio tuvo un periodonto sano. Un resultado importante del presente estudio fue la identificación de la alta presencia de bacterias periodontopáticas en los surcos subgingivales de preeclámpticas leves. P. gingivalis fue uno de los microorganismos más prevalentes, esta bacteria induce reacciones inflamatorias aceleradas por la producción de proteasas que destruyen el tejido de soporte periodontal (18). Esta característica indica porque pacientes con periodontitis tuvieron mayor frecuencia de estas bacterias en comparación con las preeclámpticas con gingivitis.

Aunque no hubo diferencia significativa en la frecuencia de A. actinomycetemcomitans entre los grupos, hubo mayor frecuencia de estas bacterias en el grupo periodontitis. Estas bacterias producen leucotoxinas, epiteliotoxinas, toxinas inductoras de la reabsorción ósea y toxinas inductoras de apoptosis (18), moléculas que aumenta la destrucción del tejido, condición que se observa en periodontitis (19). 
 
Los herpesvirus han sido estudiados y relacionados con la enfermedad periodontal (7, 20, 21). La presencia de estos virus causa un alto riesgo de manifestaciones inflamatorias periodontales. La relación dada por la presencia de estos microorganismos en muestras subgingivales (biopsias y fluido crevicular) de pacientes con enfermedad periodontal (22, 23), y por el perfil de citoquinas proinflamatorias generadas en respuesta a su infección (IL-1β, IL-6, IL-12, TNF-α, IFN-α, IFN-β, IFN-γ and IL-8). Esto fue reportado en el estudio de Wara-aswapati et al (24), quienes presentaron que la infección con CMV causa un aumento en la producción de éstas citoquinas proinflamatorias.

La diferencia en la frecuencia de herpesvirus por diagnóstico periodontal (gingivitis o perriosontitis) no fue significativa. Esto puede ser explicado porque la composición microbiológica no es el único factor que determina el progreso de la enfermedad periodontal, sino que existen otros factores externos como el uso de tabaco y características genéticas asociadas a la respuesta inmune de cada persona, que ejercen un efecto en el desarrollo de la enfermedad periodontal (19).
El bajo porcentaje en la presencia de HSV-1 en comparación con los demás herpesvirus se explica por la disminución en la frecuencia de este virus durante los proceso de reactivación viral en comparación de las primoinfecciones (25), situación de las preeclámpticas incluidas, sabiendo que éstos virus se adquieren durante la infancia. Otra razón es que ninguna de las pacientes incluidas tuvo manifestaciones herpéticas labiales o gingivoestomatitis, las cuales son las principales manifestaciones clínicas de una reactivación viral por HSV-1.

Es posible decir, que la presencia no solo de bacterias sino también de herpesvirus en el surco subgingival, inducen reacciones inflamatorias locales y sistémicas que favorecen las complicaciones durante el embarazo como la preeclampsia. Estas reacciones inflamatorias inducen un aumento en la síntesis de citoquinas proinflamatorias como IL-6, citoquina que ha sido reportada en altas concentraciones en preeclampsia leve (8) y preeclampsia severa (26), en comparación con los embarazos normales; la proteína C reactiva es otra de las moléculas que se encuentra aumentada en las gestantes preeclámpticas (27 – 29), y ésta proteína se sintetiza por el estímulo que inducen las citoquinas IL-1β, IL-6 y TNF-α.
 
Por esta razón una intervención periodontal en mujeres con preeclampsia puede reducir complicaciones durante el embarazo, como ha sido previamente reportado el tratamiento periodontal en mujeres embarazadas mejora la condición periodontal (30, 31) y es un manejo seguro que no aumenta la severidad o frecuencia de las complicaciones durante el embarazo (32).

No fue posible relacionar los niveles de hs-CRP con el diagnóstico periodontal, porque la síntesis de esta proteína es hepática, y la respuesta inmune a microorganismos periodontopáticos podría haber sido local, apoyado esto por la baja severidad en la gingivitis y periodontitis de las pacientes.

En el presente estudio, una limitante para poder hacer una correlación entre infección, inflamación y preeclampsia, es no haber contado con un grupo de madres gestantes no preeclámpticas (grupo control) con las cuales se hubiera podido hacer una comparación en la composición de la microbiota subgingival y estado periodontal.

Por lo tanto, sería necesario realizar estudios adicionales, donde la concentración de la hs-CRP sea evaluada durante los primeros meses de embarazo junto con la presencia de microorganismos periodontopáticos (bacterias y virus) y con la condición periodontal, para determinar si el aumento en esta proteína está relacionada con la cantidad y/o reactivación de los virus, y si la presencia de estos microorganismos está relacionada con la manifestación o progresión de la preeclampsia.

Los autores quieren agradecer a Adriana Jaramillo, OD, MsC y Natalia Basto MsC por su colaboración en el trabajo de laboratorio.

 

 

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