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Artículo Original

 

EVALUACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE CITOCINAS EN UN MODELO DE MACRÓFAGO U937 ESTIMULADOS CON ENDOTOXINAS DE Porphyromonas gingivalis

 

EVALUATION OF THE EXPRESSION OF CYTOKINES IN A MACROPHAGES U937 MODEL STIMULATED WITH Porphyromonas gingivalis ENDOTOXIN

 

Bernau Sebastian1, Gualtero Escobar Diego Fernando2, Lafaurie Gloria Ines3, Castellanos Jaime4

1 Biólogo Investigador instituto UIBO - Universidad el Bosque
2 OD. MS Bioquímica. Profesor asistente. Facultad de odontología. Investigador instituto UIBO - Universidad el Bosque
3 OD. Especialización Periodoncia. Profesor asociado. Facultad de odontología. Directora UIBO - Universidad el Bosque
4 OD. Doctor en Química. Profesor asociado. Director del instituto de virología - Universidad el Bosque

 


RESUMEN

Objetivo. Evaluar la expresión de seis citocinas (TNFa, IL1ß, IL-6, IL-8, IL-10 e IL- 12) expresadas por las células U937 estimuladas bajo el estimulo de LPS de Porphyromonas gingivalis ATCC (33277) y de Escherichia coli ATCC (12740). Métodos. En este estudio macrófagos U937 fueron estimulados con LPS de P. gingivalis (ATCC33277) a diferentes tiempos y concentraciones y se estimulo con LPS de E.coli (ATCC12740) como control. Las citocinas evaluadas fueron TNFa, IL1ß, IL-6, IL-8, IL-10 e IL- 12 a nivel de mRNA por RT-PCR y electroforesis en agarosa. Los niveles de expresión fueron determinados con el programa ImageJ con respecto al gen housekeeping ß-actina.
Resultados. Se encontró que las células U937 expresaron IL-6, IL1ß e IL-8 hasta por 24 horas de estímulo con LPS de P. gingivalis y E. coli a concentraciones de 50 pg/ml y 100 ng/ml. TNF a solo fue inducido por el LPS de P. gingivalis durante las primeras 6 horas de estímulo. Ninguno de los LPS indujo la expresión de IL-10 e IL-12 en macrófagos U937.
Conclusiones. Los resultados indican que los LPS a bajas concentraciones (50 pg/ml) inducen expresión de citocinas pro inflamatoria, lo que sugiere su fuerte actividad en macrófagos.

Palabras Clave. LPS, Porphyromonas gingivalis, periodontitis, macrófagos, citocinas, enfermedad cardiovascular.


ABSTRACT

Objective. Evaluate the expression of six cytokines ((TNFa, IL1ß, IL-6, IL-8, IL-10 e IL- 12) expressed by U937 cells stimulated with LPS of Porphyromonas gingivalis and Escherichia coli ATCC.
Methods. In this study, U937 macrophages were stimulated with LPS of P. gingivalis (ATCC33277) at different times and concentrations and stimulated with LPS of E. coli (ATCC12740) as a control.. The cytokines tested were TNFalfa, IL1ß, IL-6, IL-8, IL-10 and IL-12 at mRNA level with RT-PCR and agarose electrophoresis. The expression levels were determined with the ImageJ analysis software in comparison to ß-actin housekeeping gene.
Results. U937 cells expressed IL1ß, IL-6 and IL-8 up to 24 hours stimulation with LPS of P. gingivalis and E. coli at 50 pg and 100 ng / ml. TNF-a was only induced by LPS from P. gingivalis during the first 6 hours of stimulation. None of the LPS induced expression of IL-10 and IL-12 in U937 cells.
Conclusions. The results indicate that LPS at low concentrations (50 pg / ml) induces expression of pro-inflammatory cytokines, suggesting strong activity in macrophages.

Keywords. Lipopolysaccharides (LPS), Porphyromonas gingivalis, periodontitis, cytokines, macrophages, cardiovascular risk.


Introducción

La Periodontitis se ha definido como una enfermedad infecciosa crónica de los tejidos de soporte del diente, caracterizada por un proceso de destrucción inflamatorio que afecta los tejidos periodontales, lo que causa pérdida del hueso alveolar, formación de bolsas y la pérdida de los dientes (1).

Diversos estudios epidemiológicos han encontrado una asociación de riesgo entre enfermedades infecciosas con un riesgo aumentado a enfermedad cardiovascular (2). El paso de bacterias viables a la circulación periférica y su degradación en el plasma con la posterior exposición del lipopolisacárido parece ser crítico en el modelo de riesgo (3-6). Se ha establecido que endotoxemias (lipopolisacaridos en circulación) a concentraciones iguales o superiores a 50 pg/ml son consideradas como de riesgo cardiovacular para sufrir aterosclerosis en población sana (7).

El monocito y el macrófago son células ampliamente investigadas en cuanto a su activación mediada por LPS Beck (8) y Offenbacher (9) han definido que existe una marcada diferencia en la respuesta del huésped al reto bacteriano dependiente del repertorio de células T y a la capacidad secretora de los monocitos. Algunos individuos pueden responder a los componentes bacterianos tal como LPS con una respuesta inflamatoria exagerada que se refleja en la producción de altos niveles de mediadores proinflamatorios como PGE2, TNF-? e IL-1ß, así como moléculas de adhesión (VCAM-1 y ICAM-1) y quimiocinas (IL-8). La expresión de estas moléculas atraen monocitos que penetran el tejido endotelial permeabilizado, son estimulados a diferenciarse en macrofagos y se transforman en células espumosas al captar LDL oxidado presente en circulación. Las células espumosas se acumulan y las células del musculo liso proliferan, lo que conduce a la formación de placa ateromatosa. (10,11)

La relación entre riesgo cardiovascular y la enfermedad periodontal parece estar fuertemente determinada por la sobreexpresión de mediadores inflamatorios inducidos por endotoxinas, entre los más estudiados se encuentra IL1-ß, IL-6, IL-8 y TNFa (12, 13, 14). Así mismo LPS es capaza de inducir la formación de células espumosas, acumulación de esteres de colesterol (14), prostaglandina E2 y metaloproteinasa-9 (MMP9) (12).

Las citocinas son moléculas que actúan como mensajeros transmitiendo señales a las células para iniciar y mantener la respuesta inflamatoria, la respuesta inmune y la regulación del crecimiento y diferenciación celular, así como su papel en la activación de la reacción de fase aguda como mecanismo regulatorio del proceso infeccioso en el organismo que tiene como objetivo recuperar la homeostasis y neutralizar el agente causal (10).

Se ha reportado que pacientes con enfermedad periodontal expresan altos niveles séricos de citocinas proinflamatorias como la IL-1, IL-6 y TNF-a (15,16) y un aumento en estos marcadores sistémicos se han correlacionado con un aumento del riesgo cardiovascular (17,18). Se ha descrito que el proceso inflamatorio ocasiona una disminución en la expresión de la oxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) y ciclo-oxigenasa tipo I (COX-1) (19,20) lo cual incrementa la apoptosis de células endoteliales (21), aumenta la expresión de moléculas de adhesión (22), e incrementa la actividad de la NADPH oxidasa con aumento en la producción radicales libres como el superoxido (O2-) y peroxinitrito (ONOO-) (23). Es por estos mecanismos que se desarrolla la disfunción endotelial, caracterizada por un incremento en la migración de leucocitos y agregación plaquetaria, favoreciendo el desarrollo de la placa ateroesclerotica y trombosis.

La activación de macrófagos también es un proceso de alto interés para entender la relación entre riesgo cardiovascular y la enfermedad periodontal, ya que se ha reportado que en presencia de lipoproteína de baja densidad (LDL) en estado oxidado y la presencia de LPS a nivel sistémico aumentan la manifestación de ateroesclerosis, debido a que LPS altera el comportamiento del factor de transcripción ?ß y este regula varios un grupos grande de genes encargados de varios procesos celulares importantes a nivel sistémico como proliferación, migración y supervivencia celular (24-26).

Bodet et.al;(12) (2004) ha evaluado la activación de monocitos mediante el estímulo de LPS de Porphyromonas gingivalis, sin embargo, este estudio valora la activación a concentración de endotoxina más alta que las reportadas en estudios clínicos (6,7). Esto sugiere que deben hacerse valoraciones in vitro de dichas concentraciones (50pg/ml) para valorar la expresión de mediadores inflamatorios y tener un mayor acercamiento al modelo in-vivo.
El propósito de este estudio fue evaluar el modelo de macrófago humano para la valoración de citocinas proinflamamtorias en respuesta a LPS a diferentes concentraciones y tiempos, incluyendo concentraciones bajas que han sido reportadas en estudios clínicos.


Materiales y Métodos

Cultivo y mantenimiento celular.

Se utilizaron macrófagos humanos U937, una línea celular obtenida a partir de fluido pleural de un paciente con linfoma histiocítico difuso. Esta línea es importante ya que exhibe muchas características monocíticas y ha servido como un modelo para la diferenciación de monocitos a macrófagos in-vitro (27), así como para estudios relacionados con la expresión de factores dependientes de estímulos (28). Al iniciar los ensayos, las células se encontraban congeladas en nitrógeno liquido, estas fueron sacadas y puestas a baño María previamente calentado a 20ºC, por 5 minutos y fueron resuspendidas en 5ml de RPMI completo (10% suero fetal bovino (SFB), 1% antibiótico (penicilina-estreptomicina)) y fueron pasadas a cajas de cultivo de 75 cm2, en las cuales se llevo a cabo los pases y las resiembras de las células. Para los diferentes modelos de estimulación, se utilizaron placas de 6 pozos.

Estado y obtención de los lipopolisacáridos (LPS).

El LPS de E. coli (ATCC 12740) utilizado en todas las pruebas fue conseguido comercialmente de Sigma® (USA). El LPS de P. gingivalis fue purificado por cromatografía de exclusión por tamaño (Sephacryl S200) y extraído con Fenol-agua a partir del cultivo celular de la cepa ATCC 33277 en el instituto UIBO de la Universidad El Bosque (29).

Modelo de estimulación por LPS de macrófagos U937.

Para este modelo, se utilizaron placas de 6 pozos, sembradas con 300.000 células cada uno, las cuales tuvieron un periodo de establecimiento de 24h. Posterior a este tiempo se cambio el medio por uno que incluía el estímulo con LPS (100 ng/ml) y se llevo a cabo extracción de RNA a diferentes tiempos de estimulación (3h, 6h, 12h y 24h). También se valoraron diferentes concentraciones del estimulo (100 ng/ml y 50 pg/ml) a 6 horas de estimulación. Cada uno de los tratamientos fue realizado por duplicado.

Diseño de primers

La especificidad de los primers fue confirmada bioinformáticamente realizando un alineamiento contra bases de datos de RNA humano usando el programa BLASTN disponible en: www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC= BlastHomeAd).


Tabla 1. Secuencia de los primers utilizados y el peso del producto esperado

 

Extracción de RNA, RT-PCR y PCR.

A partir de la monocapa de células con LPS de P. gingivalis ATCC (33277), de E. coli ATCC (12740) o sin estimulo, se extrajo el RNA total utilizando el reactivo TRIzol® 1ml/pozo (Invitrogen. USA). Las muestras se incubaron por 5 minutos a temperatura ambiente, luego se adicionaron 200 µl de cloroformo y se incubó por 3 minutos a temperatura ambiente, se centrifugó a 12000 g por 15 minutos a 4ºC, luego se tomo la fase acuosa y se le agregaron 500 µl de isopropanol y se sometió a una nueva centrifugación. Se realizó un lavado con 1 ml de etanol seguido de centrifugación. Finalmente, el RNA fue resuspendido en 30 µl de agua tratada previamente con dietilpirocarbonato (DEPC) para inactivar cualquier RNAsa y almacenado a -80ºC.

La transcripción reversa se hizo usando un primer oligo (dT) (Promega, USA) y la enzima transcriptasa reversa MMLV (Promega, USA) durante una hora a 42ºC. Luego de esto las muestras de cDNA (ADN copia) fueron almacenadas a -20ºC.

A partir del cDNA (2.5µl) se hizo PCR , la cual contenía Cloruro de magnesio (1.5 mM), dNTP’s (0.2mM), GoTaq polimerasa, primers de citocinas (sentido y antisentido 0.5 µM) y agua grado 1 estéril para un volumen final de 25 µl por reacción. Las condiciones de amplificación fueron realizadas en un termociclador (MyCycler Thermal Cucler System, Bio-Rad) las cuales fueron, una fase inicial de desnaturalización de 2 minutos a 94°C, 30 ciclos de 45 segundos a 94ºC, 30 segundos a 60ºC, y 30 segundos a 72ºC y una fase final de extensión de 3 minutos a 72ºC.

Análisis electroforéticos

Se tomaron 10ul de los productos de amplificación y se separaron electroforéticamente en geles de agarosa al 2%, corridos a 80V durante 45 min (Biorad Power Pac 300, Cat.No 165-5050) y teñidos con bromuro de etidio (Promega, USA). Luego se fotografiaron los geles en la cámara de UV al 70% de intensidad con la cámara Leica D-Lux 3 de formato 16:9 nativo y 10 megapíxeles (1/1,65”). El peso molecular de las bandas fue determinado usando el marcador de peso molecular de 100pb (Promega, USA).

La intensidad de las bandas fueron analizadas por medio del programa ImageJ (disponible online: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html), en donde se normalizaron los valores de las intensidades de cada una de las bandas de los tratamientos con respecto al housekeeping ß-actina y se compararon directamente entre ellos.

Prueba de viabilidad celular MTT y el método de exclusión azul de Tripán.

Para cuantificar la viabilidad se llevó a cabo una prueba de MTT (30). Las células fueron sembradas en cajas de 96 pozos y luego de ser sometidas a la estimulación del LPS durante 6 horas, se remplazó el medio por MTT disuelto en RPMI a una concentración final de 1mg/ml y se incubo a 37ºC por 2 horas; luego de la corroboración microscópica de la formación de cristales de formazán, estos se solubilizaron con la adición de 100µl de dimetilsulfóxido (DMSO) y se cuantifico la absorbancia de cada uno de los pozos a temperatura ambiente a una longitud de onda de 570 nm y una sustracción del ruido de fondo a 630 nm en el lector de elisa StarFox2100, Awareness. Adicional a esta prueba de viabilidad, se hizo el ensayo de exclusión azul de tripán. Las Células U937 se estimularon bajo las mismas condiciones anteriores y fueron tratadas con azul tripán 0.25% en RPMI (1:1), 100 µl por pozo, el cual se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente, se retiro este medio y se observó al microscopio.

 

RESULTADOS

Cultivo de macrófagos humanos U-937.

El establecimiento del cultivo celular permitió la observación de la monocapa de U937 fuertemente adherente y saludable. Para todos los experimentos se usaron células entre los pasajes 2 y pasaje 4, los cuales conservaban las características propias de la línea celular y mantenían una tasa eficiente de proliferación.

Para evaluar el efecto de los LPS sobre la viabilidad celular, las células U937 fueron cultivadas y estimuladas con 100ng/ml con LPS de E. coli y P. gingivalis, y posteriormente fueron medidos viabilidad con azul de Tripán y MTT.. El resultado con azul de tripán y con la prueba MTT muestra una alta viabilidad en todos los tratamientos (datos no mostrados). Por ende, se puede afirmar que los LPS en este estudio no alteran la viabilidad de las células.

La estimulación de U937 con LPS induce una respuesta diferencial.

Debido a que los macrófagos son células sensibles a patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP), se analizó la expresión del RNAm (TNF-a, IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p40) bajo las condiciones de estimulación por LPS de P. gingivalis y E. coli durante 3, 6, 12 y 24h a 100ng/ml y 6h a 0.05ng . Las células U937 fueron cultivadas en placas de 6 pozos con medio RPMI suplementado con suero fetal bovino (10 %) y antibiótico e incubadas a 37°C y 8 % de CO2 hasta alcanzar una confluencia (90%). La respuesta de U937 tras la estimulación por 3, 6, 12 y 24h con LPS de P. gingivalis, indujo la expresión de las citocinas TNF-a, IL-1, IL-6 e IL-8, mientras que no se observó la expresión de IL-10 ni IL-12. De acuerdo al análisis por imageJ, la variación más importante durante la expresión inducida por este LPS, son los valores obtenidos para TNF-a que presenta la mayor expresión obtenida a las 3 horas de estimulación y luego decae su expresión, Por otro lado esta la expresión fuerte de IL8 a las 6 horas que se mantien constante hasta las 12 h y luego decae (figura 1.A).

Para el caso de E. coli existen cambios apreciables en los resultados; la desaparición de la expresión de TNF-a, y una expresión más marcada a través del tiempo para IL-8 en presencia del LPS (figura 1.B). El resto de citocinas (IL-1, IL-6) para los dos tratamientos se comportan de manera muy similar entre tratamientos y controles, lo que imposibilita un análisis más detallado de su comportamiento a través del tiempo.

Por último, se logró apreciar niveles de expresión de IL-1, IL-6 e IL-8 a 6h post estímulo con 50pg de LPS de E. coli y P.gingivalis, donde se encontró una respuesta débil y dejando claro que la expresión de dichas citocinas están mediadas por la concentración del estímulo (figura 2).


Discusión

Los esfuerzos por entender la asociación entre la enfermedad periodontal con el riesgo cardiovascular no solo han revelado el nivel de relación entre ellas, sino además, las complicaciones que desarrolla dicha enfermedad en nuestro organismo (9). La línea celular U937 ha sido utilizada recientemente como modelo de estudio de respuesta a antígenos virales y a alergénos (31,32), pero no ha sido valorada completamente en respuesta a factores de virulencia bacterianos. Es por esto que la idea de valorarla in vitro resulta fundamental y ayuda a la comprensión del efecto del sistema inmune frente a los diferentes factores de virulencia.
Muchos estudios realizados sobre macrófagos, sugieren que el LPS es una fuente inductora de respuesta, y no un factor que induce muerte celular. Ferrari et. Al (33)(1990) demostraron por ensayos de citotoxicidad MTT que la estimulación con LPS induce a la activación fagocítica de los macrófagos en vez de inducir su muerte.

En este estudio se encontró la expresión de mRNA de IL-1ß, IL-6, IL-8 y TNF-a en la línea celular U937 bajo estímulo de LPS de P. gingivalis, mientras que no se encontró la expresión de TNF-a tras el estímulo con LPS de E.coli. Agarwal et. al;(34)(1995) encontraron concordancia entre la expresión de mensajeros para IL-1ß, IL-6, IL-8 y TNF-a en monocitos humanos estimulados con LPS de P. gingivalis y E. coli bajos las mismas condiciones, mostrando una expresión más marcada de dichos mensajeros bajo el estímulo de P. gingivalis, esto muestra la tendencia por parte de los monocitos a tener una mayor inducción de respuesta en presencia de altas concentraciones de LPS, lo que explica el comportamiento diferencial en la expresión de mensajeros de citocinas (IL-1ß, IL-6, IL-8 y TNF-a) cuando fueron valoradas con diferentes concentraciones de LPS. Además, existieron diferencias en la inducción de respuesta en las células U937 entre los LPS analizados; esto sugiere que la estimulación por LPS con estructura clásica (E.coli) induce una repuesta diferente a la de los LPS con estructura no clásica (P. gingivalis), ya que esto dependerá de la configuración estructural del LPS inherente a una especie (35-37). El TNF-a es un marcador de respuesta inmune innata característico a estímulo por LPS de E. coli, sin embargo bajo las condiciones experimentales del presente trabajo esta citocina no fue expresada por las U937 con LPS de E. coli. Sin embargo cuando se valoró la expresión de esta citocina por monocitos aislados de sangre periférica se demostró que el LPS de E. coli a una concentración de 100ng/ml inducia la expresión de TNFa luego de 6 horas de estimulo (datos no mostrados). Estos resultados siguieren que el modelo de macrófago de U937 debido tal vez a su naturaleza tumoral, presenta alguna alteración molecular que le impide responder a este LPS secretando TNFa.

Con referencia a los diferentes tiempos de evaluación, Cassatella et.al;(38)(1993) afirma que cada tipo de célula inmune, expresa de manera diferencial las citocinas dependiendo de su rol en el sistema, así mismo varia la intensidad de la señal dependiendo del tiempo de exposición, concentración y tipo de estímulo. Los resultados aquí mostrados difieren de esta idea para IL-1ß e IL-6 pero reflejan lo obtenido para TNF-a e IL-8. Esto puede explicarse debido a la posibilidad de tener la presencia de interferencias en los medios de cultivo utilizados.

Por último cabe destacar la capacidad de las U937 de inducir la transcripción de genes de citocinas proinflamatorias tras el estímulo a concentraciones de 50 pg/ml. Estas concentraciones bajas de LPS a nivel sistémico son consideradas como de riesgo cardiovascular (39). Por tanto la expresión de citocinas por macrófagos a están concentraciones resaltarían el papel de endotoxemias causadas por microorganismos periodontopaticos y su intervención en la enfermedad cardiovascular en pacientes con periodontitis como ha sido sugerido en otros estudios (40).

El resultado de la no expresión de TNF-a bajo el estimulo de LPS de E.coli, puede estar reafirmando lo mostrado el trabajo de Sharif et.al;(24)(2007), quienes plantean que la línea de macrófagos humanos U937 se diferencian de la línea THP-1 del mismo tipo celular con respecto a la regulación y expresión de ciertos genes controlados por el factor NF-?ß, principal factor transcripcional que regula la respuesta a LPS.

Basándose en esta evidencia y aclarando que la línea THP-1 se asimila mas al modelo in-vivo de macrófago, podemos afirmar que la línea U937 podría tener algunas características aberrantes (proveniente de una línea celular tumoral) que limitan la evaluación de algunas citocinas al tener ciertos dominios o proteínas alteradas que la diferencian de su par. Esto podría ser una sugerencia para resolver lo encontrado en el caso de TNF-a por estimulo de LPS de E.coli.

Conclusiones

La línea celular de macrófago U937 es útil para el estudio de la expresión de citocinas bajo el estímulo de lipopolisacáridos de bacterias periodontopaticas. La línea celular de macrófago U937 expresa citocinas aun en bajas concentraciones de LPS consideradas como de riesgo cardiovascular.

 

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